Cell子刊 | 蛋白質(zhì)組標桿大牛： 揭示糖尿病新機制還得從這類修飾入手
原文：
Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.02.012
不知大家還記得否？去年小編曾報道了一篇Science的重磅文章，由來自德國馬普生物化學研究所Matthias Mann團隊，利用磷酸化組發(fā)現(xiàn)了阿片類藥物副作用機制（最新Science重磅：磷酸化組學揭秘阿片類藥物副作用潛在機制）。
僅過半年多時間，該研究團隊馬不停蹄地又發(fā)表了一篇力作。最近，該團隊在Cell Metabolism期刊上發(fā)表了題為“Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets”的研究，通過磷酸化蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組學技術，揭示GSK3-PDX1軸是胰島糖尿病致病關鍵信號節(jié)點。
可見，磷酸化修飾組已成為尋找醫(yī)藥研究領域機制探索的重要技術手段。
研究背景
糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組以長期高血糖為主要特征的代謝綜合征,伴隨很多合并癥和并發(fā)癥，其中90%是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)。2型糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，其發(fā)病機理為胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌缺陷，或胰島素分泌缺陷為主伴胰島素抵抗和肝臟葡萄糖產(chǎn)生增加。
越來越多的研究表明，胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。然而目前胰島β細胞功能紊亂具體分子機制仍不完全清楚。因此，系統(tǒng)性了解β細胞功能紊亂機制將有助于對于糖尿病的治療和預防。
此前，利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組研究2型糖尿病發(fā)病機制已有諸多報道，但是從磷酸化角度發(fā)現(xiàn)關鍵調(diào)控信號通路的報道卻不多。磷酸化是調(diào)控胰島分泌重要機制，因此，從整體磷酸化水平研究胰島素分泌的調(diào)節(jié)機制有著十分重要的意義。
研究材料
正常小鼠（C57BLKS-Leprdb/+）和糖尿病小鼠（C57BLKS-Leprdb）胰島組織；
研究結(jié)果
01、磷酸化組、蛋白質(zhì)組
分析正常、糖尿病小鼠模型的蛋白修飾變化
研究人員首先對正常小鼠和糖尿病小鼠的胰島開展了label free蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組學的分析。結(jié)果共定量到6552個蛋白，超過14000個不同的磷酸化位點。
蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的PCA分析顯示，根據(jù)其不同糖尿病狀態(tài)明顯的將胰島分為兩群（圖1B、C）。在糖尿病組（db/db小鼠）中，上調(diào)表達的蛋白質(zhì)顯著富集于炎癥過程，而參與胰島素分泌的關鍵蛋白質(zhì)顯著下調(diào)表達（圖1D、E）。此外，db/db組幾乎所有mTOR/S6K底物磷酸化水平增加。
圖1. 研究技術路線
02、組學生信分析
發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠胰島中信號通路重構
為了探討調(diào)控磷酸化蛋白質(zhì)組水平變化的機制，作者對db/db胰島中顯著變化的激酶底物motif進行分析（圖2A）。結(jié)果顯示，與高營養(yǎng)素誘導mTOR激活一致，p70S6K底物motif顯著富集，而AMPK motif下調(diào)表達。其他激酶motif，如ERK1/2和AKT同樣下調(diào)表達（圖2B）。此外，調(diào)節(jié)胰島素分泌包括PKA、PKC和CaMK幾種主要激酶的motif下調(diào)表達，該結(jié)果表明胰島β細胞在高葡萄糖誘導后不能正常分泌胰島素。
作者進一步想了解在胰島細胞缺陷條件下信號通路如何整體重新布局。db/db胰島中PKA和PKC底物發(fā)生顯著的去磷酸化， 其催化底物的表達水平減少（圖2C）。糖尿病胰島中，高營養(yǎng)水平誘導mTOR通路激活，進而通過p70S6K-IRS1/2負反饋弧導致AKT抑制。AKT活性降低進而引起其直接作用底物磷酸化水平的降低，GSK-3β是AKT的重要底物，其活性受AKT的負調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，在db/db胰島中，GSK-3β的Ser9磷酸化抑制，同樣地GSK-3β 的Tyr216的酪氨酸磷酸化水平顯著上調(diào)，該結(jié)果進一步證實GSK-3β在糖尿病胰島中活性增加。PDX1 的是GSK3 β 和HIPK2直接作用底物，后者通過磷酸化Ser269可引起該蛋白進行蛋白酶體降解。結(jié)果顯示，糖尿病胰島中，PDX1的Ser269的磷酸化水平上升，蛋白水平受影響，而其mRNA水平不受影響。結(jié)合文獻和本實驗數(shù)據(jù)表明，在糖尿病胰島中信號傳導軸從mTOR通路激活開始，通過mTOR激活GSK3β，PDX1降解。
圖2. db/db小鼠胰島中的關鍵信號通路被調(diào)節(jié)
03、挖掘致病關鍵信號軸
db/db胰島中PDX1（胰腺十二指腸同源框蛋白1）抑制使得GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運子）下調(diào)表達以及抑制β細胞糖酵解
研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病組的胰島中GSK-3β 激活，導致PDX1降解，這也確定了PDX1在β細胞生理學中的重要性。那么在β細胞中PDX1下游靶標的表達是否同樣受到影響？結(jié)果顯示，與對照組相比，db/db胰島中所有PDX1的靶標都顯著下調(diào)表達，其中GLUT2蛋白下調(diào)表達程度最大(圖3A)。GLUT2作為一種葡萄糖感受器，能夠有效調(diào)節(jié)血糖濃度，密切參與葡萄糖誘導的胰島素分泌。
此外，糖尿病胰島中參與糖酵解和TCA循環(huán)途徑的關鍵酶顯著下調(diào)表達，該變化從整體上影響了葡萄糖代謝（圖3B）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)幾乎所有呼吸酶的底物的表達水平均顯著下調(diào)，降低的糖酵解代謝導致ATP/ADP濃度比降低，進而可負反饋影響下游胰島素分泌機制。而對蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)的分析也表明許多參與胰島素細胞外分泌的蛋白顯著下調(diào)表達。
圖3. GLUT2抑制與糖酵解抑制相關
04、磷酸化組、蛋白質(zhì)組在人胰島中驗證信號軸功能
糖毒性觸發(fā)GSK3依賴PDX1下調(diào)表達
在糖尿病過程中，不同的因素協(xié)同作用引起β細胞丟失和功能障礙。慢性或周期性暴露β細胞會導致葡萄糖和脂質(zhì)或干擾β細胞功能促炎細胞因子水平提高。此外也有研究報道，GSK-3β可調(diào)控葡萄糖體內(nèi)平衡。實驗結(jié)果也揭示了GSK-3β活化導致PDX1抑制，進而導致糖尿病胰島中胰島素分泌機制損傷。因此，作者進一步研究糖毒性是否可獨立觸發(fā)β細胞中GSK-3β激活，繼而導致PDX1轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶標的降解。作者對三個不同志愿者胰島和INS1e大鼠β細胞分別給予高葡萄糖處理，隨后對其進行蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組學分析（圖4A）。結(jié)果顯示，在響應慢性葡萄糖水平上升的過程中，一共約有7000個蛋白和19000磷酸化位點發(fā)生變化。
為了探討PI3K-AKT-GSK3以及其他關鍵信號通路激活狀態(tài)，通過組學數(shù)據(jù)以及結(jié)合文獻報道的信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人胰島和大鼠β細胞中，慢性高血糖癥導致GSK3激活。同時還發(fā)現(xiàn)隨后GSK3的靶標磷酸化水平提高，PDX1 的Ser268磷酸化水平上升，導致其降解（圖4B）。PDX1靶標的表達水平，包括GLUT2和INS在db/db胰島中均下調(diào)表達（圖4C）。
后續(xù)作者進一步驗證GSK3在調(diào)控PDX1穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)錄靶標GLUT2關鍵作用。首先，作者通過單獨或使用蛋白酶體抑制劑MG132, 通過抑制PI3K激活GSK3處理人胰島。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK3激活有效的導致PDX1降解和GLUT2抑制。更重要的是，GSK3激活的同時影響了葡萄糖誘導胰島素的分泌。那么抑制GSK3是否可改善糖尿病癥狀。作者通過使用GSK3抑制劑LY2090314處理肥胖小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該處理不僅恢復GLUT2和PDX1表達，同時完全恢復胰島分泌胰島素能力（圖4）。
圖4. 糖毒性誘導GSK3依賴PDX1下調(diào)表達
05、結(jié)論
作者通過基于質(zhì)譜的高通量磷酸化蛋白組、蛋白質(zhì)組學技術，結(jié)合生物信息分析，深入比較了正常和糖尿病小鼠胰島的磷酸化蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組信號網(wǎng)絡圖。 最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK3是胰島素分泌的關鍵調(diào)節(jié)節(jié)點，抑制GSK3能恢復了糖尿病胰島分泌胰島素的能力。
小編總結(jié)
糖尿病是一類非常常見的代謝性疾病。雖然此前，關于糖尿病有大量組學報道的，包括利用轉(zhuǎn)錄組學以及蛋白質(zhì)組學來研究不同2型糖尿病動物模型或人胰島，但是，這些研究主要是從參與β細胞損傷的差異基因或差異蛋白的角度進行分析，但大規(guī)模分析該疾病的磷酸化信號網(wǎng)絡變化的研究卻甚少。
正是利用了更為新穎的修飾組學進行研究，該文為我們呈現(xiàn)了一幅細致的糖尿病磷酸化網(wǎng)絡水平關鍵信號通路變化圖，并最終發(fā)現(xiàn)了胰島素分泌的關鍵調(diào)節(jié)信號軸。因此，對于一些利用轉(zhuǎn)錄組等常規(guī)組學做的較為深入的疾病而言。我們不妨從更為新穎的修飾組學入手，去挖掘一些新的疾病致病機制。
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