看這里！miRNA怎樣蹭上m6A熱點發(fā)高分？

文章導(dǎo)讀
胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。m6A甲基化修飾是pri-miRNA加工和成熟的重要機制，但其異常調(diào)控在人類疾病中的作用尚不清楚。本研究作者發(fā)現(xiàn)，吸煙產(chǎn)生的香煙煙霧冷凝液（cigarette smoke condensate，CSC）能夠通過m6A修飾誘導(dǎo)miR-25-3p前體成熟，從而促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。

 

發(fā)表期刊：NATURE COMMUNICATIONS
影響因子：12.353
實驗方法：miRNA測序、m6A pri-miRNA測序、ChIP qPCR、RNA pull down
實驗材料：CSC（香煙煙霧冷凝液），DMSO（普通化學(xué)溶解劑），胰腺導(dǎo)管腺癌細胞，胰腺細胞等

1. CSC誘導(dǎo)PDAC細胞中致癌基因miR-25-3p過表達
CSC處理胰管上皮細胞和未處理組分別進行miRNA測序（云序可提供此服務(wù)），篩選到實驗組中差異高表達的miRNA----miR-25-3p。并且，miRNA的表達量對CSC濃度正相關(guān)。前面是細胞中的情況，接著作者檢測了抽煙和不抽煙人群胰腺組織中miRNAs的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在吸煙者中也是高表達的。在正常和胰腺癌細胞中，也發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在癌細胞中顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明抽煙和PDAC疾病會導(dǎo)致miR-25-3p的表達量顯著上調(diào)。接著作者又結(jié)合臨床指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p高表達的PDAC病人生存時間較短。同時，miR-25-3p與細胞增殖、遷移和侵襲表型相關(guān)。

圖1. CSC誘導(dǎo)miR-25-3p及其對PDAC患者存活時間的影響

那么問題來了，CSC是如何導(dǎo)致吸煙者體內(nèi)miR-25-3p的高表達呢？

2.CSC促進METTL3介導(dǎo)的pri-miR-25成熟
為進一步闡明CSC誘導(dǎo)miR-25-3p的分子機制，作者首先檢測了CSC處理PDAC細胞時pri-miR-25、pre-miR-25和miR-25-3p的表達情況，發(fā)現(xiàn)CSC處理能夠降低pri-miR-25表達同時增加pre-miR-25和miR-25-3p表達，暗示CSC可能通過調(diào)控pri-miR-25的加工和成熟來誘導(dǎo)miR-25-3p的高表達。由于m6A甲基化修飾在miRNA前體加工和成熟過程中起著重要的調(diào)控作用，作者檢測了幾個重要的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，查看這些酶是否會影響CSC誘導(dǎo)的miR-25-3p的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSC會誘導(dǎo)METTL3高表達且呈現(xiàn)濃度依賴性，但對METTL14和WTAP表達無影響。隨后，作者做進一步驗證，發(fā)現(xiàn)在PDAC細胞中過表達METTL3酶，能夠顯著降低pri-miR-25水平，升高pre-miR-25和miR-25-3p水平，反之亦然。同時，敲減METTL3也顯著降低CSC誘導(dǎo)的miR-25-3p表達。以上數(shù)據(jù)暗示，CSC可能通過提高METTL3的表達，進而促使miR-25-3p高表達。

圖2.  CSC通過上調(diào)METTL3的表達促進了pri-miR-25的成熟

那么問題來了，CSC是如何提高METTL3的表達呢？

3.CSC誘導(dǎo)METTL3啟動子低甲基化并促進其表達
首先，作者通過DNA甲基化低通量驗證技術(shù)（云序可提供此服務(wù)），證實CSC能夠抑制MeTTL3基因啟動子區(qū)域的甲基化程度。通過ChIP-qPCR（云序可提供此服務(wù)）實驗，結(jié)果顯示CSC處理能夠降低DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3a在METTL3啟動子的結(jié)合。這種情況在吸煙者的胰腺組織中同樣存在。接著作者通過生信分析確定了調(diào)控METTL3的4個潛在轉(zhuǎn)錄因子，但在腫瘤和非腫瘤的胰腺組織中只有NFIC這個轉(zhuǎn)錄因子與METTL3的mRNA表達水平呈正相關(guān)。為進一步驗證，作者在PDAC細胞中敲減NFIC，發(fā)現(xiàn)METTL3和miR-25-3p的表達量顯著降低。此外，吸煙者的非腫瘤胰腺組織中NFIC在METTL3啟動子的結(jié)合同樣顯著增加。以上結(jié)果表明，CSC通過降低METTL3啟動子區(qū)域的DNA甲基化，使其與轉(zhuǎn)錄因子NFIC結(jié)合，進而促進METTTL3的表達。

 

圖3. CSC通過降低METTL3啟動子區(qū)甲基化促進其表達

4.METTL3通過調(diào)控m6A修飾介導(dǎo)pri-miR-25成熟
為進一步探索了METTL3是否影響miR-25-3p成熟，作者首先通過m6Apri-miRNA甲基化測序（云序可提供此服務(wù)）分析了pri-miR-25上的m6A位點，發(fā)現(xiàn)m6A的確存在于pri-miR-25剪切位點。MeRIP-qPCR（云序可提供此服務(wù)）分析顯示，PDAC樣本中pri-miR-25的m6A修飾比非PDAC樣本要高很多。同樣的，CSC處理增加細胞中pri-miR-25的m6A修飾；而過表達METTL3同樣增加pri-miR-25的m6A修飾，敲減METTL3則相反。這些結(jié)果暗示METTL3在m6A的形成和miR-25-3p的成熟中發(fā)揮著重要作用。為檢測m6A是否直接調(diào)控miR-25成熟，作者利用體外轉(zhuǎn)錄的含m6A的pri-miR-25（[m6A]pri-miR-25）和不含m6A修飾的pri-miR-25進行了體外RNA成熟實驗，結(jié)果顯示，[m6A]pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25顯著增加；當(dāng)pri-miR-25上METTL3結(jié)合區(qū)域發(fā)生突變后，pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25顯著降低。這些體外結(jié)果與細胞內(nèi)相一致，提示吸煙者和PDAC病人中高表達的miR-25-3p可能是由于香煙刺激導(dǎo)致METTL3高表達，增加pri-miR-25上m6A修飾所致的。

圖4. METTL3通過調(diào)控m6A修飾促進pri-miR-25成熟

5. NKAP為pri-miR-25中m6A的識別蛋白
為找到pri-miRNA的reader酶，作者通過RNA Pull Down（云序可提供此服務(wù)）聯(lián)合質(zhì)譜，找到22個與pri-miRNA m6A結(jié)合的蛋白。DGCR8是pri-miR-25加工成熟過程中重要的酶，做coIP（云序可提供此服務(wù)）后發(fā)現(xiàn)有9個蛋白與DGCR8相互作用。兩者取交集后發(fā)現(xiàn)NKAP，為pri-miR-25中m6A的識別蛋白。

 

圖5. NKAP是pri-miR-25中m6A的識別蛋白

6. miR-25-3p靶向PHLPP2激活A(yù)KT-p70S6K信號通路
接下來，作者研究了miRNA與其靶基因的作用機制，借助生信分析預(yù)測了miR-25-3p的潛在靶基因PHLPP2。通過熒光素酶和過表達以及敲除實驗證實PHLPP2確實是miR-25-3p的潛在靶基因。最后，對文章進行了升華，證實靶基因參與了AKT信號通路并影響p70S6K磷酸化水平。

 

圖6. 在PDAC中吸煙可通過miR-25-3p激活A(yù)KT-p70S6K信號

總結(jié)
在本研究中，作者首先通過miRNA高通量測序手段，在CSC處理組中篩到表達最高的miR-25-3p，并在臨床和功能上意義重大。
隨后，作者兵分兩路，深入挖掘miR-25-3p差異表達原因及其功能。
一方面：證實CSC誘導(dǎo)METTL3啟動子低甲基化并通過轉(zhuǎn)錄因子NFIC使其表達升高，從而增加pri-miR-25的m6A甲基化程度；一方面：找到了pri-miR-25的m6A甲基化識別蛋白為NKAP，通過與miRNA成熟加工蛋白DGCR8和Drosha形成復(fù)合體促進pri-miR-25成熟為miR-25-3p；最后通過生信手段找到miR-25-3p的靶基因PHLPP2，證實其通過激活A(yù)KT癌癥信號通路促進PDAC的發(fā)生和發(fā)展。

全文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-09712-x
 

云序相關(guān)產(chǎn)品推薦：

• m6A pri-miRNA測序

• m6A全轉(zhuǎn)錄組測序

• m6A環(huán)狀RNA測序

• m6A LncRNA測序

• m6A mRNA測序

• miRNA測序

• RNA Pull Down

• RIP測序

• DNA甲基化測序

• DNA甲基化PCR

• ChIP測序

• ChIP PCR

往期回顧：

• MicroRNA-182調(diào)控Sirt1誘導(dǎo)的糖尿病角膜神經(jīng)再生

• 10分以上m6A RNA甲基化測序文章----云序生物助力

• 占領(lǐng)C位！云序生物解析如何做到快速同時檢測各類癌癥當(dāng)中RNA甲基化相關(guān)酶&RNA甲基化水平(上)

• 占領(lǐng)C位！云序生物解析如何做到快速同時檢測各類癌癥當(dāng)中RNA甲基化相關(guān)酶&RNA甲基化水平(下)

• 云序生物客戶最新文章：ChIP-seq&mRNA-seq聯(lián)合應(yīng)用

• 云序客戶12分頂級文章，教你如何巧用RIP測序玩轉(zhuǎn)分子機制！

• Nat. commun | Mettl3介導(dǎo)的m6A RNA甲基化調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞和骨質(zhì)疏松癥的命運

• Nature | SMAD2/3與TGF-β通路協(xié)同影響轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生m6A RNA甲基化調(diào)控干細胞發(fā)育

• Nature | m6A RNA甲基化識別蛋白YTHDF1參與記憶的形成

• 不得了，大牛告訴你lncRNA甲基化如何研究

• 小白必看！RNA甲基化整體水平鑒定的方法匯總

• 云序生物最新“RNA 甲基化”研究匯總-擬南芥篇

• Nature突破性研究—RNA甲基化新修飾m1A 云序生物

• 2018年Nature雜志重磅級突破性研究成果--m5C RNA甲基化 云序生物

• 云序生物最新m6A“RNA甲基化”研究匯總—非編碼RNA篇

• 云序生物最新m6A“RNA甲基化”研究匯總—病毒篇

• RNA甲基化已經(jīng)火成這樣子了，你還在等什么！最新云序生物m6A“RNA甲基化”研究

• 云序生物獨家首發(fā)m5C RNA甲基化測序

• RNA甲基化 震撼來襲！

上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址：上海市松江區(qū)莘磚公路 518 號 20 號樓 3 樓
電話：021-64878766
傳真：021-64878766
網(wǎng)址：www.cloud-seq.com.cn
郵箱：market@cloud-seq.com.cn