敲降斑馬魚基因的方法學(xué)比較

一、基因敲降的前期準(zhǔn)備工作相同
1.1 生物信息學(xué)分析目標(biāo)基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)送過程中是否有表達(dá)。
1.2 收集斑馬魚早期發(fā)育胚胎（通常為48 hpf前的胚胎），提取總RNA，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（RT）。
1.3 設(shè)計(jì)檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)的PCR引物，以1.2獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確認(rèn)目標(biāo)基因在早期有表達(dá)。
 
二、MO法與CRISPRi法的敲降原理不同
2.1 MO是在轉(zhuǎn)錄后水平上敲降基因的功能（MO-Spl阻遏原始轉(zhuǎn)錄本的剪接，MO-Atg阻遏成熟轉(zhuǎn)錄本的翻譯）（基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控）
2.2 CRISPRi 是在轉(zhuǎn)錄水平上敲降基因的功能（抑制基因的轉(zhuǎn)錄）(基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控）。
 

• 敲降工具有效性驗(yàn)證的方法不同

3.1 嗎啡啉敲降法（確認(rèn)有效性）的技術(shù)路線
抑制翻譯的MO（MO-Atg）和抑制剪接的MO（MO-Spl）二者敲降基因的有效性評(píng)價(jià)方法不同。抑制剪接的MO（MO-Spl）的有效性評(píng)價(jià)方法是通過RT-PCR直接檢測(cè)原始mRNA轉(zhuǎn)錄本的正常剪接是否被改變；抑制翻譯的MO（MO-Atg）的有效性評(píng)價(jià)通常需要通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測(cè)。但是，由于適用于斑馬魚的抗體很少，過去一般通過報(bào)告基因法來進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)（參見我們發(fā)表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，但后來斑馬魚領(lǐng)域給出的MO使用指南（見已發(fā)表的研究論文：Stainier et al., 2017. Plos Genetics, 13(10): e1007000）指出這種報(bào)告基因評(píng)價(jià)法缺乏特異性，因而不再推薦該報(bào)告基因評(píng)價(jià)方法。也正是由于沒有相應(yīng)比較方便的評(píng)價(jià)方法，一般不推薦此種抑制翻譯（MO-Atg）的MO敲降法。確認(rèn)抑制剪接的MO（MO-Spl）敲降基因有效性的技術(shù)路線如下：
3.1.1 分析斑馬魚目標(biāo)基因的基因組組成（外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)），然后針對(duì)該基因，設(shè)計(jì)阻遏原始轉(zhuǎn)錄本剪接的嗎啡啉（morpholino）（MO-Spl）。
注：MO-spl不能阻止母源轉(zhuǎn)錄本的翻譯，如果要阻止母源轉(zhuǎn)錄本的翻譯，需要設(shè)計(jì)阻遏原始轉(zhuǎn)錄本翻譯的嗎啡啉（MO-Atg）。
3.1.2 訂購(gòu)嗎啡啉MO-Spl或MO-Atg和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照MO。
3.1.3 將不同濃度的MO-Spl注射入斑馬魚受精卵（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照MO僅注射最高濃度）
3.1.4 待注射胚胎發(fā)育至特定時(shí)期（優(yōu)選48 hpf前的某些時(shí)期），收集胚胎，提取總RNA，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（RT）。
3.1.5 按1.3已建立的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，確認(rèn)目標(biāo)基因的原始轉(zhuǎn)錄本的正常剪接是否被阻遏（發(fā)生異常剪接）。同時(shí)，設(shè)置檢測(cè)管家基因表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照，確認(rèn)整個(gè)RT-PCR過程正常。
注：如果是使用MO-Atg，則無簡(jiǎn)單易行的有效性檢測(cè)方法（一般不做有效性檢測(cè)，僅開展特異性檢測(cè)）。
3.1.6 分析3.1.5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定MO敲降工具的有效性，以及實(shí)現(xiàn)有效敲降的最低注射濃度。
 
3.2 CRISPRi敲降法（確認(rèn)有效性）的技術(shù)路線
CRISPRi敲降的有效性可以通過RT-PCR法檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)水平是否被有效下調(diào)來進(jìn)行直接評(píng)價(jià)。一般使用普通半定量RT-PCR即可，確有需要，可以考慮定量RT-PCR法確認(rèn)敲降程度。
3.2.1 分析目標(biāo)基因的基因組結(jié)構(gòu)，確定目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和/或5’UTR位置。 根據(jù)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的特征，設(shè)計(jì)sgRNA識(shí)別位點(diǎn)---CRISRP序列的設(shè)計(jì)（不少于4個(gè)）。
3.2.2 體外合成至少4條不同的sgRNA（每基因）和 dCas9-Eve mRNA。
3.2.3 將4條sgRNA按不同濃度和dCas9-Eve mRNA混合后共同注射斑馬魚受精卵。同時(shí)以相同濃度的dCas9-Eve mRNA注射受精卵作為空白對(duì)照。
3.2.4 待注射胚胎發(fā)育至特定時(shí)期（優(yōu)選48 hpf前的某些時(shí)期），收集胚胎，提取總RNA，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（RT）。
3.2.5 按1.3已建立的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確認(rèn)目標(biāo)基因的表達(dá)水平是否被有效抑制（阻遏轉(zhuǎn)錄）。同時(shí)，設(shè)置檢測(cè)管家基因表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照，確認(rèn)整個(gè)RT-PCR過程正常。
3.1.6 分析3.2.5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定CRISPRi敲降工具的有效性，以及實(shí)現(xiàn)有效敲降的最低注射濃度。
 
四、CRISPRi敲降方法的特異性優(yōu)于MO法的特異性
基因敲降方法的特異性需要通過表型拯救的方法來回答。之所以需要表型拯救，是因?yàn)樾枰�排除基因敲降的表型是由于敲降工具的脫靶或者敲降試劑本身的毒性而�?dǎo)致的非特異表型，換句話說，要排除敲降表型是源于基因敲降工具的脫靶或者試劑本身的毒性所造成的這種可能。
拯救的基本實(shí)驗(yàn)策略是：在基因敲降的基礎(chǔ)上，過表達(dá)被敲降的基因（通常是同時(shí)顯微注射目標(biāo)基因的戴帽mRNA），然后觀測(cè)原來出現(xiàn)的表型是否被恢復(fù)（或有所恢復(fù)）至正常（參見我們發(fā)表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果基因敲降的表型在過表達(dá)目標(biāo)基因的mRNA后有很好的拯救，那么可以確認(rèn)敲降方法是特異的。
基于基因組編輯技術(shù)的CRISPRi敲降方法，一般同時(shí)注射4個(gè)sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)sgRNA引導(dǎo)dCas9-Eve所發(fā)揮的抑制基因表達(dá)的功能遠(yuǎn)沒有多個(gè)sgRNA同時(shí)引導(dǎo)dCas9-Eve發(fā)揮的抑制功能強(qiáng)（參見我們發(fā)表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，這種多個(gè)sgRNA的協(xié)同作用決定了CRISPRi法脫靶作用可以忽略，而RNA本身的毒副作用是完全可以進(jìn)行對(duì)照的（使用一組僅注射dCas9-Eve mRNA作為對(duì)照）。
相對(duì)而言，MO的脫靶效應(yīng)要大很多。事實(shí)上，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明：即使有多達(dá)5 bp的錯(cuò)配，MO也會(huì)發(fā)生作用。而對(duì)于一個(gè)25 nt長(zhǎng)的MO而言，5 bp錯(cuò)配在基因組中的類似序列可以是成白上千。因此，MO敲降的脫靶機(jī)會(huì)很大。
另外，有研究報(bào)道注射MO可異常激活斑馬魚p53基因的表達(dá)，非特異性地誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞凋亡，因此，在很多情況下，如果使用MO作基因敲降，是需要同時(shí)注射敲降p53基因的MO以抑制過表達(dá)的p53（請(qǐng)參考已發(fā)表的文獻(xiàn)Robu et al., 2007. PLoS Genet. 3(5):e78）。
窗體底端
窗體底端
再者，如果MO自身就存在毒性（源于序列本身或者化學(xué)合成過程），則是無法進(jìn)行對(duì)照的。MO方法剛發(fā)明不久，就有研究指出即使是同一種序列，不同批次合成的產(chǎn)品的毒性也可能是不一樣的，顯然，這種“內(nèi)在”的毒性是無法進(jìn)行對(duì)照的。
 
五、CRISPRi敲降工具（RNA形式）供貨周期遠(yuǎn)短于MO敲降工具
由于MO工具需要在美國(guó)合成，受進(jìn)口手續(xù)、海關(guān)通關(guān)等的影響，到貨時(shí)間一般不少于30個(gè)工作日。而CRISPRi敲降工具（RNA形式）完全有本公司自主生產(chǎn)（已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利，專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610843834.8），不超過20個(gè)工作日（一般為10個(gè)工作日）即可制作好，干冰寄送（到貨）。
 
六、CRISPRi敲降工具（RNA形式）的費(fèi)用低于MO法的敲降工具（人民幣元）

基因敲降工具	基因敲降工具成分	單價(jià)	備注
6.1 MO敲降工具設(shè)計(jì)與合成	1） 阻遏基因原始轉(zhuǎn)錄本剪接或翻譯的嗎啡啉 （300 nmol） 2）對(duì)照組嗎啡啉 （100 nmol）	4,700 + 1,500 =6,200	1） 對(duì)照實(shí)驗(yàn)通過注射標(biāo)準(zhǔn)MO對(duì)照實(shí)現(xiàn) 2） 可供注射100次以上（每次注射400枚胚胎） 3） 常溫運(yùn)輸
6.2 CRIPSRi敲降工具設(shè)計(jì)與合成	1）dCas9-Eve mRNA 2）4 個(gè) sgRNA  3）無核酸酶污染超純水（供稀釋用）	5,300 （是MO工具費(fèi)用的85.5%）	1）對(duì)照實(shí)驗(yàn)通過注射dCas9 mRNA來實(shí)現(xiàn) 2）可供注射100次以上（每次注射400枚胚胎） 3）干冰運(yùn)輸

 
七、優(yōu)先推薦CRISPRi法敲降斑馬魚基因
一般來說，一個(gè)基因的敲降方法如果尚未見報(bào)道的話，僅以一個(gè)MO敲降的話，未來發(fā)表論文時(shí)，審稿人一般會(huì)要求需要再有一個(gè)獨(dú)立敲降的方法重復(fù)前一個(gè)MO的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其原因也非常簡(jiǎn)單，因?yàn)榛�因是否被成功敲降是研究基因缺失功能的前提。只有確認(rèn)基因本身被成功特異敲降，才能開始后續(xù)的功能研究（表型分析）。在不確定敲降方法是否有效且特異的情況下，所有獲得的結(jié)果毫無疑問都是值得存疑的。
因此，我們推薦使用CRISPRi + MO 法同時(shí)進(jìn)行敲降同一個(gè)基因（參見我們發(fā)表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055）。在使用兩種獨(dú)立的、原理完全不同的敲降方法后，如果得到的敲降效果（表型）是一樣的，那么這樣建立的基因敲降方法毫無疑問可以被認(rèn)可是有效且特異的。
如果一定只想先選用一種基因敲降方法篩選初步評(píng)價(jià)基因缺失功能，我們優(yōu)先推薦CRISPRi法，理由如前述（有效性高、脫靶機(jī)會(huì)小、毒副作用小、供貨周期短、價(jià)格便宜）。