免疫治療相關(guān)的人源化動物模型

昨日，美國FDA批準(zhǔn)了全球第二個CAR-T上市，用于治療特定非霍奇金淋巴瘤，這是繼諾華的首個CAR-T療法的又一次重大突破。腫瘤免疫療法頻傳捷報，特別是以嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)（CAR-T）以及免疫檢查點(diǎn)阻斷技術(shù)為代表的新興腫瘤免疫療法，發(fā)揮著巨大潛力�？紤]到該療法臨床前評估需要接近人類免疫系統(tǒng)且具備不用于普通抗癌藥物的評價方式，本期我們就特別為大家介紹，這些炙手可熱的免疫療法中，需要用到的人源化動物模型。

腫瘤免疫療法為什么需要人源化動物？

腫瘤免疫療法是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫防御機(jī)制來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，需要建立在免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)上，但是哺乳動物的免疫系統(tǒng)均具有物種特異性。因此，需要具備接近人類免疫系統(tǒng)的動物模型進(jìn)行臨床前治療效果及安全性評估。

最早，利用進(jìn)化地位較接近于人的猩猩作為研究模型，但這一做法在歐洲和美國相應(yīng)被禁止。后來，出現(xiàn)了嚙齒類動物人源化，尤其是人源化小鼠，它能精確地模擬人的生物學(xué)系統(tǒng)，為人類的生物學(xué)研究提供了新了動物模型的選擇。

什么是人源化小鼠？

攜帶人源細(xì)胞、組織或者基因的動物模型，與免疫治療相關(guān)的人源小鼠即移植免疫相關(guān)的人源細(xì)胞或者人源基因的動物模型。

如在NRG、NSG等免疫缺陷小鼠體內(nèi)經(jīng)移植人造血干細(xì)胞（HSCs）和外周血單核細(xì)胞（PBMCs)后可體內(nèi)研究人的生物學(xué)過程一類小鼠。又如敲入人類基因的小鼠，主要是以免疫檢查點(diǎn)阻斷技術(shù)的人源化小鼠如hPD-1，hCTLA-4。

因在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著不可忽視的作用，人源化小鼠也就成為了臨床前人類生物醫(yī)學(xué)研究的“明星鼠”

因此，免疫治療中的人源化小鼠主要分為2類：免疫系統(tǒng)缺陷小鼠和表達(dá)人源基因的小鼠。下面就具體看看這2類小鼠構(gòu)建過程及其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

一、免疫缺陷小鼠

免疫缺陷小鼠是指由于先天遺傳突變或用人工方法造成一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動物。這類小鼠由于免疫系統(tǒng)缺陷，可適用于人源細(xì)胞或組織異種移植，而不產(chǎn)生或者產(chǎn)生較低的免疫排斥，廣泛用于臨床前的生物醫(yī)學(xué)的研究，因此被稱為人源化小鼠。

目前，常見的免疫缺陷鼠有裸鼠，SCID，NOD/SCID，NRG或NSG小鼠。其中NRG，NSG小鼠均是由于無成熟T細(xì)胞、B細(xì)胞和功能性NK細(xì)胞，細(xì)胞因子信號傳遞能力缺失等特點(diǎn)，成為世界上公認(rèn)的重度免疫缺陷小鼠。下面重點(diǎn)為大家講述這類小鼠的構(gòu)建過程及應(yīng)用。

NRG，NSG小鼠

1. NRG, NSG小鼠的構(gòu)建

這2種小鼠一般利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，在NOD小鼠的背景下進(jìn)行相應(yīng)基因敲除。

（1）NRG（Rag2^-/-, IL-2rg^-/-）小鼠：將Rag2，IL-2rg雙敲除[1]

①Rag2：在5`UTR和3`UTR上分別設(shè)計一個sgRNA，將1號外顯子敲除；

②IL-2rg：在1號和7號外顯子上各設(shè)計一個sgRNA，將2-6號外顯子敲除；

③經(jīng)過顯微注射sgRNA后，可以得到NRG小（2）NSG（Prkdc^-/-,IL-2rg^-/-）小鼠：Prkdc，IL-2rg 雙敲除

①IL-2rg：敲除方式同NRG小鼠設(shè)計方案；

② Prkdc：可在5`UTR和第5號外顯子上分別設(shè)計一個sgRNA，將1-4號外顯子敲除；

③經(jīng)過顯微注射sgRNA后，可以得到NSG小鼠。NSG也可以通過NOD/SCID 與IL-2rg^-/-小鼠交配獲得。
2. NRG，NSG小鼠的在免疫治療中的應(yīng)用

在免疫治療中，一般需要重建人類免疫系統(tǒng)才可更準(zhǔn)確進(jìn)行藥效評價。由于該類小鼠重度免疫缺陷，可將來源于病人的組織或細(xì)胞移植到小鼠身上。如將人的造血干細(xì)胞及T細(xì)胞通過尾靜脈移植到NRG或NSG小鼠。

①由于NRG，NSG小鼠均能支持較高水平的人造血干細(xì)胞，外周血及T細(xì)胞的移植，因此，NRG 或NSG小鼠廣泛用于血液系統(tǒng)疾病，自身免疫疾病的研究[2]。

②其中，經(jīng)移植人造血干細(xì)胞（HSCs），外周血單核細(xì)胞（PBMCs)到NRG或NSG小鼠后可得到重建人的免疫系統(tǒng)的小鼠為體內(nèi)研究人類感染性疾病，自身免疫，腫瘤發(fā)生發(fā)展，再生醫(yī)學(xué)，免疫治療等生物學(xué)進(jìn)程提供可能[3]。如圖-1所示：

圖-1 在NSG等免疫缺陷小鼠上重建人類免疫系統(tǒng)

③結(jié)合當(dāng)前領(lǐng)域中炙手可熱的 CAR-T，即植入新的抗原受體后的T細(xì)胞移植到已荷瘤的NRG或NSG小鼠后，用于臨床前評估CAR-T的治療效果及安全性。例如，表達(dá)CD33特異性抗原受體的T細(xì)胞治療白血病可在NSG小鼠上進(jìn)行臨床前治療評價[4]（如圖-2）。

圖-2  CART33對荷白血病細(xì)胞系在NSG小鼠的治療效果評價[4]

優(yōu)化的人源化小鼠（遞送人類的細(xì)胞因子）

盡管，當(dāng)前備受矚目的NRG、NSG小鼠應(yīng)用廣泛，極大推進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)程。但仍存在較多問題，一個主要因素是小鼠細(xì)胞因子與相對應(yīng)的人的細(xì)胞因子交互反應(yīng)影響人的HSCs，PBMCs的發(fā)育和功能。

因此，給人的HSCs，PBMCs一個完整的人的細(xì)胞因子的環(huán)境，將遞送人的細(xì)胞因子到NRG或NSG宿主鼠上，使其為人類細(xì)胞移植提供一個理想的環(huán)境，將會促使NRG或NSG小鼠成為更為理想的臨床前動物模型。

例如：SIRPα是表達(dá)在巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，造血前體細(xì)胞表面受體，它與配體CD47結(jié)合激活SIRPα信號通路進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞的吞噬活性，這將阻止細(xì)胞表面表達(dá)CD47分子細(xì)胞被吞噬。

SIRPα高度多態(tài)，雖然在NOD背景的小鼠中編碼的SIRPα蛋白能與人的CD47結(jié)合，進(jìn)而促使被移植到NRG或NSG小鼠上的細(xì)胞通過CD47-SIRPα信號通路逃離吞噬。

然而，非NOD背景的人源化小鼠中，如BRG小鼠，人的CD47 不能與BRG小鼠的SIRPα進(jìn)行結(jié)合，因此，此類人源化小鼠則需要將人的SIRPα替換小鼠SIRPα基因，從而BRG小鼠為人類細(xì)胞移植提供一個較為理想的環(huán)境，如下圖-3。

圖-3  在BRG小鼠中SIRPα被人的SIRPα基因替換[5]

又如：移植人的CD34⁺造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞到NRG，NSG小鼠中，雖然能夠產(chǎn)生多種類型的造血干細(xì)胞，包括T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹突細(xì)胞，紅細(xì)胞和血小板。

但是，其中一些細(xì)胞系的發(fā)育及其功能并不理想�？赡茉�因是人的細(xì)胞因子與小鼠的細(xì)胞因子相互作用，從而使移植的人的細(xì)胞生存及生長受到影響[5]。因此，為人源化小鼠提供更多的人的細(xì)胞因子（表-1）將促使當(dāng)前的NRG,NSG等人源化小鼠更加接近于人的環(huán)境。

表-1 最優(yōu)化人源小鼠的一些人的細(xì)胞因子[5]

二、表達(dá)人基因的人源化小鼠

利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)構(gòu)建表達(dá)人基因的小鼠。在免疫治療中，以免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠最為典型。

因?yàn)槊庖邫z查點(diǎn)是人體免疫系統(tǒng)的重要功能性組成部分，可通過升高（激活免疫檢查點(diǎn)）或者降低（抑制免疫檢查點(diǎn)）免疫信號來調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，通過靶向免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行免疫治療也成為未來腫瘤治療中一個新型治療方法（如圖-4）。

圖-4  靶向免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行免疫治療的原理圖[6]

基于此，將人的免疫檢查點(diǎn)基因替換小鼠相同基因，同時破壞小鼠免疫檢查點(diǎn)的基因功能（如PD-1, CTLA4等）制作免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠。即可將來源于相應(yīng)遺傳背景的小鼠細(xì)胞或者組織移植于免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠上，用于驗(yàn)證人源化抗體的藥效的研究。下面詳細(xì)介紹該類模型，主要包括單個和多個免疫檢查點(diǎn)的人源化小鼠。

1. 單個免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠

這里以PD-1為例，簡述hPD-1人源化小鼠的構(gòu)建[6]（上一期我們是以ES打靶技術(shù)為大家講解過h PD-1構(gòu)建，這次我們講述基于CRISPR/Cas9 技術(shù)的構(gòu)建過程）如圖-5：

（1）首先，對比分析小鼠與人PD-1基因，將人的PD-1胞外結(jié)合區(qū)替換成小鼠胞外結(jié)合區(qū)，可將人的2號外顯子替換小鼠的2號外顯子來實(shí)現(xiàn)；

（2）利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，在2號外顯子兩側(cè)分別設(shè)計sgRNA，并同時構(gòu)建含有人的序列的打靶載體，共注射受精卵，即可得到PD-1人源化小鼠，同時破壞小鼠PD-1基因。

圖-5  PD-1 人源化小鼠的設(shè)計方案

2. 多個免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠

由于免疫反應(yīng)是多個免疫信號通路相互作用的結(jié)果，雙免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠應(yīng)運(yùn)而生。如hPD-1 與hCTLA-4小鼠交配即可得到PD-1與CTLA-1雙免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠。多個免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠則需要構(gòu)建更多免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠，之后進(jìn)行交配。

由于，免疫反應(yīng)是多個免疫信號通路相互作用的結(jié)果，因此，未來多個免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠，也是研究人源化抗體藥物理想的動物模型。目前，比較熱門的免疫檢查點(diǎn)如圖-6。

圖-6 目前比較熱門免疫檢查點(diǎn)

小鼠設(shè)計注意事項

免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠構(gòu)建應(yīng)與所選擇的做實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系遺傳背景保持一致，一般選擇C57BL/6遺傳背景上做基因改造，用相應(yīng)的遺傳背景的細(xì)胞系進(jìn)行做實(shí)驗(yàn)。

作基因替換時，一般選擇相應(yīng)基因功能domain 進(jìn)行替換或者全部替換，其次若基因過長，次選擇大小鼠相應(yīng)基因ATG后敲入人的CDS。無論何種方式，最后均要驗(yàn)證其人的基因表達(dá)情況。

3. 免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠應(yīng)用

①進(jìn)行PD-1/PD-L1、CTLA4等免疫檢查點(diǎn)阻斷的治療性單克隆抗體或相關(guān)化合物的體內(nèi)給藥處理，檢測臨床前體內(nèi)人源化抗體藥物的篩選與評價。如圖-7，人源化的CTLA4小鼠可用于評價人源化抗體K4G4, L1B11,L3D10的抗腫瘤效果。

②與其它免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠交配成多免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠，用于臨床前體內(nèi)多個人源化抗體藥物聯(lián)合用藥抗腫瘤藥效的評價。

圖-7  利用人源化CTLA4小鼠進(jìn)行人源抗體藥物篩選[7]

綜上所述，本期我們?yōu)榇蠹医榻B了腫瘤免疫療法中的2種重要人源化動物模型：重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠以及人源化免疫檢查點(diǎn)小鼠。另外，在研究中發(fā)現(xiàn)將CAR-T療法結(jié)合PD-1/PD-L1信號通路阻斷可進(jìn)一步加大腫瘤治療效果，是免疫治療的重要發(fā)展方向（如圖-8）。

圖-8  PD-1/PD-L1阻斷與CART組合治療腎腫瘤[8]

未來隨著基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫療法領(lǐng)域的應(yīng)用，以及多種治療手段與免疫療法組合的聯(lián)合治療方式的出現(xiàn)，對相關(guān)動物模型的建立和優(yōu)化也提出了更高的要求，相信在未來，腫瘤免疫療法相關(guān)動物模型也必將經(jīng)歷一系列的開發(fā)和優(yōu)化過程。

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