如何用Western blot法驗(yàn)證PCR結(jié)果

往期我們已經(jīng)為大家詳細(xì)介紹了利用CRISPR/Cas9構(gòu)建編輯小鼠和細(xì)胞系的全部過程，相信大家在了解從sgRNA設(shè)計(jì)、表達(dá)載體構(gòu)建至顯微注射、小鼠鑒定等一系列過程的同時(shí)，常會為這樣的難題所困擾：歷經(jīng)3-6個月得到的基因敲除的小鼠/細(xì)胞，PCR鑒定的結(jié)果居然和WB蛋白結(jié)果不一致？竟開始懷疑自己這幾個月是不是白做了？灰心的絕望著：自己是不是不適合搞科研！小編溫馨提示：不要驚慌，打開本文你就知道，究竟你編輯的小鼠/細(xì)胞是不是正確的？

基因編輯小鼠/細(xì)胞的鑒定方法之PCR

目前PCR方法因具有快速、靈敏、費(fèi)用低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于對基因編輯小鼠基因型鑒定的實(shí)驗(yàn)中。一般而言，針對不同基因修飾類型的小鼠，需要設(shè)計(jì)不同的引物來進(jìn)行鑒定。

• 實(shí)驗(yàn)原理：首先，設(shè)計(jì)能與引入的外源基因結(jié)合的特異性引物，擴(kuò)增原本不存在于動物基因組中的DNA序列；對于基因敲除小鼠和細(xì)胞，則在基因修飾的位置針對靶點(diǎn)上下游約200~300bp區(qū)域分別設(shè)計(jì)正反向PCR引物。突變型和野生型PCR產(chǎn)物的大小應(yīng)不同，大小區(qū)別在100bp以上的，可以直接用凝膠電泳區(qū)別鑒定；若無法用凝膠電泳直接鑒定的基因型，可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測序驗(yàn)證。

• 實(shí)驗(yàn)過程：提取基因修飾動物的DNA、用PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶序列、瓊脂糖凝膠電泳、檢測DNA片段的有無和大小，進(jìn)一步測序以確定基因型。具體操作步驟如下圖1，我們也在往期有詳細(xì)介紹（鏈接：基因編輯小鼠——基因型鑒定，2016-11-2）   

圖1.  小鼠基因型鑒定步驟

問題來了，WB鑒定蛋白與PCR測序結(jié)果不一致怎么辦？

如當(dāng)我們委托第三方構(gòu)建小鼠或細(xì)胞時(shí)，第三方公司提供的鑒定報(bào)告一般只包括上述提到的基因組DNA水平的PCR和測序結(jié)果，即保證在DNA 水平的敲除，并以此給出模型已經(jīng)構(gòu)建成功的結(jié)論！但是我們往往需要去驗(yàn)證蛋白的功能，因?yàn)榈鞍撞攀巧�物學(xué)功能的最終執(zhí)行者。這樣就導(dǎo)致了一種現(xiàn)象，默認(rèn)蛋白Western blot（WB）檢測結(jié)果本該像中心法則那樣，與基因組水平的DNA測序結(jié)果相對應(yīng)，然而卻發(fā)現(xiàn)蛋白的WB結(jié)果與DNA的PCR和測序結(jié)果不一致，我們開始慌了，這究竟怎么回事，這個模型沒有構(gòu)建成功？如果遇到這種問題，我們該如何處理呢？

首先，我們需明確: WB鑒定的結(jié)果不一定可靠！

1.  WB只是建立在DNA序列正確基礎(chǔ)上檢測蛋白表達(dá)的一種手段，其結(jié)果不能單方面作為鑒定結(jié)果的判斷。

運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建編輯的基因敲除小鼠或者細(xì)胞是在基因組水平對靶向基因進(jìn)行了目標(biāo)DNA序列的敲除（圖2）�；�因（Gene）是核酸分子中儲存信息的遺傳單位，是指儲存有功能的蛋白多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列，因此蛋白的合成是在基因的指導(dǎo)下完成的。也就是說基因是蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)，沒有DNA序列的改變就不會有蛋白表達(dá)的改變，所以鑒定DNA序列的改變是最為基礎(chǔ)的。

圖2.  CRISPR/Cas9 介導(dǎo)DNA敲除原理圖[1]

2.   有WB條帶不一定就代表蛋白還有功能！

基因敲除一般分為兩種情況：一種是把目的基因的DNA外顯子編碼序列全部敲除；第二種是敲除外顯子上部分編碼蛋白的序列，因?yàn)榍贸�的外顯子序列為非三的整數(shù)倍，所以這種情況會造成蛋白翻譯移碼突變，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了相應(yīng)蛋白功能的敲除。因此如果通過對目標(biāo)序列進(jìn)行PCR和測序鑒定確定目的基因在DNA水平刪除了相應(yīng)DNA 序列的話，相應(yīng)的蛋白就會因?yàn)槿鄙僬�確的DNA翻譯模板無法合成正確的蛋白。而WB抗體本身存在一定的非特異性結(jié)合，有可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。所以，有WB條帶不一定就代表蛋白還有功能。

舉個例子：

有研究者曾經(jīng)發(fā)表文章（WeiqunYu et al. 2013）來檢驗(yàn)P2Y₆蛋白商品化抗體的特異性和有效性，作者依據(jù)兩個標(biāo)準(zhǔn)篩選了3家公司的商品化抗體：

1）候選的抗體曾經(jīng)有研究者驗(yàn)證過抗體的特異性并曾在公開刊物上發(fā)表；

2）候選的抗體針對P2Y6蛋白不同部位的抗原表位。

曾經(jīng)使用候選抗體并公開發(fā)表的文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和各抗體廠家的使用說明書上的資料都顯示，所選的抗體在特異性和有效性上都具有很大的潛力。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明WT小鼠和P2Y6基因敲除小鼠抗體檢測結(jié)果并無明顯差異（圖3），雖然其中兩種抗體在該研究者的實(shí)驗(yàn)之前都有不少于一篇的文獻(xiàn)證明其他研究者使用該抗體得到了非常好的特異性和漂亮的圖片結(jié)果。那造成這種不一致現(xiàn)象的原因可能是在不含有P2Y6的組織中，仍然存在著能被該抗體識別的其他抗原。

圖3.  三種不同 P2Y6 抗體特異性檢測[2]

所以，WB的結(jié)果有時(shí)并不那么可信，因此不推薦采用WB來驗(yàn)證！那除了PCR測序和WB驗(yàn)證，還有其他什么方法呢？

基因表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄及翻譯兩階段，轉(zhuǎn)錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白的過程（圖4），檢測基因的表達(dá)就是檢測特異mRNA及特異蛋白的生成。所以基因表達(dá)檢測分為兩個水平：即轉(zhuǎn)錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白的檢測。

圖4.  基因表達(dá)翻譯原理圖[3]

1.   轉(zhuǎn)錄水平上對特異mRNA的檢測：

主要方法有Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈，也可用RT-PCR （reverse transcribed PCR）方法檢測DNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其原理是以小鼠或細(xì)胞總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后再經(jīng)PCR擴(kuò)增或熒光定量PCR；如果從小鼠組織或細(xì)胞總RNA提取物中沒有得到特異的cDNA擴(kuò)增條帶，則能從轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證了基因敲除。

2.   翻譯水平上對蛋白功能的檢測：

主要是對蛋白生物學(xué)活性的檢測，如果我們敲除的基因具有生化反應(yīng)活性或其他的生物學(xué)活性，那么我們還可以通過相應(yīng)的酶反應(yīng)或者生物學(xué)活性來進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證。

綜上所述，基因型的鑒定應(yīng)以PCR測序?yàn)闇?zhǔn)，在蛋白水平的WB驗(yàn)證并不是判斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)，我們可以從該基因的生物活性或者RNA轉(zhuǎn)錄水平入手，多角度驗(yàn)證小鼠或細(xì)胞系的基因敲除。

參考文獻(xiàn)：

[1] Maeder,M.L. & Gersbach, C.A. Genome-editing Technologies for Gene and CellTherapy.Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy(2016).

[2] Weiqun Yu&Warren G. Hill. Lack of specificity shown by P2Y6 receptor antibodies.Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol(2013) 386:885–891.

[3] http://203.92.44.117/mirtronPred/