eccDNA新型生物標(biāo)志物的多種應(yīng)用

新年伊始，eccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）的相關(guān)研究成果不斷。2019年11月同期Nature、Cell報(bào)道了環(huán)狀DNA通過高度開放染色質(zhì)、復(fù)雜的拓樸異構(gòu)特征增強(qiáng)表達(dá)的顛覆性發(fā)現(xiàn)，2019年12月Nature Genetics也剛剛揭示了eccDNA能夠驅(qū)動(dòng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤基因重排的全新功能。這一次，PNAS（美國(guó)科學(xué)院院刊）報(bào)道了香港中文大學(xué)盧煜明教授團(tuán)隊(duì)的最新研究成果，該成果顯示孕婦血漿中可以鑒定出母親和胎兒的游離環(huán)狀DNA。正如文章中的描述，“優(yōu)于線性DNA的生物穩(wěn)定性以及獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)特征讓eccDNA在迅速發(fā)展的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的道路增添了新的方向”�？煲黄饋�(lái)看看這次有關(guān)eccDNA又有哪些新的發(fā)現(xiàn)吧！

原文鏈接：Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma

發(fā)表期刊：PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）

影響因子：9.58

發(fā)表日期: 2019.12.03

實(shí)驗(yàn)方法：eccDNA-seq （云序生物可提供此項(xiàng)服務(wù)）

1. 血漿中eccDNA檢測(cè)

eccDNA高通量檢測(cè)的關(guān)鍵步驟是要通過實(shí)驗(yàn)手段對(duì)其進(jìn)行有效的富集。研究者通過線性DNA的去除、eccDNA的純化、建庫(kù)、測(cè)序，生物信息分析對(duì)反式剪切位點(diǎn)（junction site）的識(shí)別從而完成對(duì)eccDNA的鑒定。5例孕期女性的血漿樣品中eccDNA的富集與高通量測(cè)序結(jié)果顯示：1）核酸外切酶V（exoV）去除線性DNA的過程對(duì)eccDNA的富集效果非常明顯；2）同一個(gè)體血漿中的eccDNA與線性DNA相比最顯著的特征在于長(zhǎng)度分布。線性DNA長(zhǎng)度在166bp左右富集，而MspI方法純化的eccDNA主要在202和338bp處有明顯集中，并且338bp處的eccDNA數(shù)目要明顯多于202bp附近的eccDNA個(gè)數(shù)。

圖1 線性DNA和eccDNA長(zhǎng)度比較

2. 胚胎源和母源eccDNA檢測(cè)比較

之前的研究結(jié)果顯示胚胎源（fetal origin）和母源（maternal origin）血漿中線性DNA分子在長(zhǎng)度分布不同，通過SNP的方式對(duì)eccDNA分子進(jìn)行來(lái)源分類，結(jié)果顯示5例孕期女性個(gè)體的eccDNA長(zhǎng)度均在約202bp和約338bp兩個(gè)地方有明顯富集，但是總體來(lái)講累積分布曲線顯示胚胎源eccDNA長(zhǎng)度分布總體位于左側(cè)，換言之胚胎源的eccDNA長(zhǎng)度要短于母系eccDNA，這種趨勢(shì)和兩種來(lái)源線性的DNA長(zhǎng)度的差異趨勢(shì)保持一致。

圖2 eccDNA長(zhǎng)度分布和來(lái)源多樣性

3. eccDNA的片段化方法優(yōu)化

此項(xiàng)研究當(dāng)中使用的MspI處理方法有一個(gè)缺陷，就是MspI總是識(shí)別酶切位點(diǎn)的特征序列CCGG，這種識(shí)別模式對(duì)于長(zhǎng)片段eccDNA更有利，因?yàn)樵摲肿痈�有可能含有CCGG序列，利用Tn5隨機(jī)剪切的特性能夠有效的解決這一問題，極大的提高eccDNA的檢出。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示胚胎源eccDNA長(zhǎng)度主要分布在202bp和338bp附近，相比于母源eccDNA，胚胎源的分子長(zhǎng)度相對(duì)較短。

圖3 eccDNA MspI和Tn5剪切效果對(duì)比

4.母體血漿中eccDNA基因組注釋

母體血漿當(dāng)中的eccDNA分子主要來(lái)源于5’UTR區(qū)，外顯子區(qū)以及CpG島，在Alu原件相對(duì)較少。這一分布規(guī)律和小鼠組織、非孕期人群血漿當(dāng)中的eccDNA分布保持一致。eccDNA的來(lái)源位置并非完全隨機(jī)，而是具有一定的偏好性，但母源和胚胎源的eccDNA分布無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過比較eccDNA反式剪切位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，少數(shù)剪切位點(diǎn)（322，0.018%）在5例孕期個(gè)體當(dāng)中都被檢測(cè)到。

圖4 eccDNA的染色體分布

5. eccDNA形成位點(diǎn)的motif探索

eccDNA的反式剪切位點(diǎn)附近是否有motif特征性序列可以闡釋eccDNA的成環(huán)機(jī)制？文章中對(duì)成環(huán)片段的上游和下游序列進(jìn)行了進(jìn)一步討論，剪切位點(diǎn)上下游各50bp左右的位置的motif分析結(jié)果明確了4bp的“空間隔板”，文章中把這種模型描述為“重復(fù)模式（recurrent pattern）”。在S1、S2兩側(cè)分別由四個(gè)重復(fù)區(qū)域，1區(qū)和3區(qū)序列相同，2區(qū)和4區(qū)相同，計(jì)算機(jī)模擬顯示出現(xiàn)這種模式的概率是0.056%，而測(cè)序結(jié)果當(dāng)中為3.484%，這種模型非常有利于同源重組和微同源介導(dǎo)的末端剪切，而這一現(xiàn)象也符合經(jīng)典的eccDNA成環(huán)機(jī)制。

本篇文章聚焦孕期女性血漿當(dāng)中的eccDNA檢測(cè)。不同于線性DNA，eccDNA長(zhǎng)度更長(zhǎng)，母系來(lái)源的eccDNA比胚胎來(lái)源的eccDNA分子長(zhǎng)度也更長(zhǎng)。成環(huán)位點(diǎn)上下游的信息有效的提示了可能的eccDNA形成機(jī)制，為接下來(lái)eccDNA的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。這些成果都有利于推動(dòng)eccDNA在液體活檢以及生物標(biāo)志物方面的應(yīng)用。

2020年年初的寒潮并不能冰凍eccDNA在科研界的火熱。重量級(jí)期刊的文章發(fā)表已經(jīng)為我們一年的科研指明了方向，游走在線性DNA之外的eccDNA將是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最閃亮的星。新分子，新方向，機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，運(yùn)氣與實(shí)力同在，祝愿各位生物醫(yī)學(xué)的工作者在新的一年能搶占先機(jī)，eccDNA將是您科研新年新氣象的不二選擇。

序說時(shí)刻：

云序生物聚焦科研熱點(diǎn)，從國(guó)內(nèi)率先提供環(huán)狀RNA測(cè)序，到m6A測(cè)序，再到如今eccDNA測(cè)序，我們不斷為科研工作者提供最新的科研方向，最好的思路，助力科研用戶發(fā)表高分文章。2020年我們風(fēng)起云涌，序勢(shì)待發(fā)!

云序生物染色體外環(huán)狀DNA測(cè)序技術(shù)服務(wù)：

云序生物提供染色體外環(huán)狀DNA測(cè)序服務(wù)（eccDNA-seq），利用核酸酶對(duì)線性DNA水解獲得目的環(huán)狀DNA，不僅檢測(cè)到的有效數(shù)據(jù)量高，還能夠深入分析在特定腫瘤癌癥中相關(guān)eccDNA的特異表達(dá)、基因組分布以及拷貝變異等，從而幫助客戶快速找到癌癥、腫瘤機(jī)理研究和診斷的靶向eccDNA。

云序優(yōu)勢(shì) 

國(guó)內(nèi)率先提供該服務(wù)的測(cè)序公司： 率先開發(fā)出成熟的測(cè)序流程，成為國(guó)內(nèi)目前率先提供該服務(wù)的測(cè)序公司。 

富集效率高：染色體外環(huán)狀DNA的富集效率是決定數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵，云序生物精心優(yōu)化和研發(fā)的實(shí)驗(yàn)流程，具有極高的富集效率和特異性。 

識(shí)別率高：專業(yè)的生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì)，通過優(yōu)化的算法能夠高效識(shí)別染色體外環(huán)狀DNA。

 一站式服務(wù)： 客戶只需提供細(xì)胞、組織或基因組DNA，云序生物為您完成從樣品準(zhǔn)備、環(huán)狀DNA富集、文庫(kù)制備、上機(jī)測(cè)序到數(shù)據(jù)分析的整套服務(wù)流程

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