體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)方法及導(dǎo)則

體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)方法及導(dǎo)則
體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)在化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗(yàn)列為第2個(gè)組織/終點(diǎn)的體內(nèi)試驗(yàn)；體內(nèi)哺乳動(dòng)物堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則（TG489）也已頒布。體內(nèi)堿性彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)DNA鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、不完整切除修復(fù)引起的DNA鏈的斷裂等任何感興趣，能夠制成合適細(xì)胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗(yàn)相比其檢測(cè)的是單細(xì)胞水平的DNA損傷，因此該試驗(yàn)敏感性較高，操作簡單，經(jīng)濟(jì)省時(shí)。
實(shí)驗(yàn)原理
彗星實(shí)驗(yàn)（comet assay）也稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一種有效評(píng)估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經(jīng)處理（如輻射、重金屬等）后，細(xì)胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場(chǎng)作用下，DNA 斷片遷移出細(xì)胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的大分子DNA在電場(chǎng)作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細(xì)胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實(shí)驗(yàn)（pH=8.4）和堿性彗星實(shí)驗(yàn)（pH＞13）。中性彗星實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實(shí)驗(yàn)具有更高的靈敏性，可用于檢測(cè)更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。
需要注意的是，試驗(yàn)過程中的個(gè)方面，包括樣品準(zhǔn)備、電泳條件、視覺分析參數(shù)(如染色強(qiáng)度、顯微鏡光強(qiáng)度以及使用顯微鏡濾鏡和相機(jī)動(dòng)態(tài)和環(huán)境條件(如背景照明)已經(jīng)被研究，可能影響DNA遷移。
堿性彗星試驗(yàn)指導(dǎo)原則
TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals
試驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)證明能夠?yàn)樗�使用的目�?biāo)組織獲得足夠質(zhì)量的單細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液，從而在彗星試驗(yàn)中建立實(shí)驗(yàn)?zāi)芰�，北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司可提供專業(yè)毒理學(xué)服務(wù)。首先通過%尾DNA的評(píng)價(jià)，對(duì)照處理組動(dòng)物%尾DNA在低范圍內(nèi)。目前的數(shù)據(jù)表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數(shù))在大鼠肝臟應(yīng)該最好不要超過6%,這將是符合JaCVAM驗(yàn)證試驗(yàn)的值和其他出版和私有數(shù)據(jù)。目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)對(duì)其他組織的最佳或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測(cè)試報(bào)告應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)或?qū)Ｓ袛?shù)據(jù)，對(duì)彗星試驗(yàn)在這些組織中的性能進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶彶椤Ｊ紫�，在�?duì)照組中，需要一個(gè)較低的%尾DNA范圍，以提供足夠的動(dòng)態(tài)范圍來檢測(cè)陽性的影響。其次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)能夠按照表1所建議的不同方式，對(duì)直接誘變劑和促進(jìn)劑的反應(yīng)。

表一：陽性對(duì)照物質(zhì)及其部分靶組織

陽性對(duì)照物	靶組織
Ethyl methanesulfonate	任何組織
Methyl methanesulfonate	肝臟、胃、十二指腸或空腸，肺和支氣管肺泡灌洗(BAL)細(xì)胞，腎臟，膀胱，肺，睪丸和骨骼骨髓/
Ethyl nitrosourea	肝胃，十二指腸或空腸
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine	胃、十二指腸或空腸
1,2-Dimethylhydrazine 2HCl	肝臟和腸
N-methyl-N-nitrosourea	肝臟，骨髓，血液，腎臟，胃、空腸和大腦。

應(yīng)收集陰性對(duì)照數(shù)據(jù)，以證明陰性數(shù)據(jù)反應(yīng)的再現(xiàn)性，并確保對(duì)檢測(cè)的技術(shù)方面進(jìn)行適當(dāng)控制，或建議需要重新建立歷史控制范圍。
歷史對(duì)照
在實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證過程中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立歷史數(shù)據(jù)庫，建立相關(guān)組織和物種的陽性和陰性對(duì)照范圍和分布。不同的組織和不同的物種，以及不同的給藥溶媒和給藥途徑，可能會(huì)產(chǎn)生不同的%尾DNA陰性對(duì)照值。因此，建立每個(gè)組織和物種的陰性對(duì)照范圍是很重要的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用質(zhì)量控制方法，以確定其數(shù)據(jù)的變化程度，并表明該方法在其實(shí)驗(yàn)室中得到了“控制”�？赡苓�需要優(yōu)化選擇適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照物質(zhì)、劑量范圍和實(shí)驗(yàn)條件(例如電泳條件)，以便發(fā)現(xiàn)微弱的影響。
對(duì)實(shí)驗(yàn)方案的任何更改都應(yīng)根據(jù)其與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有歷史控制數(shù)據(jù)庫的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應(yīng)導(dǎo)致建立新的歷史控制數(shù)據(jù)庫。
方法描述
動(dòng)物選擇：通常使用健康成年嚙齒動(dòng)物(6-10周齡，但年齡稍大的動(dòng)物也可接受)。
動(dòng)物準(zhǔn)備：動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。在開始實(shí)驗(yàn)前，這些動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件至少5天，給予標(biāo)識(shí)識(shí)別。試驗(yàn)開始時(shí),動(dòng)物的重量差異應(yīng)該不超過±20%。
樣品制備：在給動(dòng)物給藥前，固體測(cè)試化學(xué)品應(yīng)溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)娜苊街校�或混合在飲食或飲用水中。液體試驗(yàn)化學(xué)品可直接加藥或在加藥前稀釋。對(duì)于吸入暴露，根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)，試驗(yàn)化學(xué)品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。
溶媒：在使用的劑量范圍內(nèi)，溶媒不應(yīng)產(chǎn)生毒性作用，也不應(yīng)與試驗(yàn)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。如果使用的不是常用溶媒應(yīng)提供參考數(shù)據(jù)，說明它們?cè)跍y(cè)試動(dòng)物、管理路線和終點(diǎn)方面的兼容性。建議在可能的情況下，應(yīng)首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是，一些溶劑可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平，尤其是與多藥給藥時(shí)。
陰性對(duì)照：陰性對(duì)照動(dòng)物，單獨(dú)用溶媒處理，其他處理方法與治療組相同，每一次采樣時(shí)間和組織的每次檢測(cè)均納入一組陰性對(duì)照動(dòng)物。陰性對(duì)照動(dòng)物的尾部DNA應(yīng)在每個(gè)組織預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)室背景范圍和該物種的取樣時(shí)間內(nèi)。
動(dòng)物數(shù)量和性別：目標(biāo)是每組提供至少5只可分析的單性別動(dòng)物，或如果使用兩種動(dòng)物，則每組至少提供5只可分析的單性別動(dòng)物。如果人類接觸到的化學(xué)物質(zhì)可能具有性別特異性，例如某些藥物，則應(yīng)在適當(dāng)?shù)男詣e下進(jìn)行檢測(cè)。三個(gè)劑量組和同時(shí)進(jìn)行的陰性和陽性對(duì)照(每一組由5只單性別動(dòng)物組成)，將需要25至35只動(dòng)物。
試驗(yàn)計(jì)劃：動(dòng)物應(yīng)接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時(shí)進(jìn)行兩次或兩次以上)，并在最后一次治療后的2-6小時(shí)采集一次樣本。延長劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測(cè)試化學(xué)品也可以分次使用，即，兩組給藥在同一天間隔不超過2-3小時(shí)，便于給藥量大。在這種情況下，取樣時(shí)間應(yīng)根據(jù)最后一次給藥的時(shí)間來安排。
劑量水平：對(duì)無毒試驗(yàn)化學(xué)品，給藥14天以上的，最大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時(shí)間少于14天，最高劑量為2000毫克/公斤體重/天。
采樣時(shí)間：采樣時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵變量，因?yàn)樗�是由測(cè)試化學(xué)物質(zhì)在目標(biāo)組織中達(dá)到最大濃度所需的時(shí)間和DNA鏈斷裂的誘導(dǎo)時(shí)間決定的，但在這些斷裂被移除、修復(fù)或?qū)е录?xì)胞死亡之前。
組織收集：因?yàn)樗�可以研究誘導(dǎo)的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應(yīng)清晰、基于收集的原因進(jìn)行研究與任何現(xiàn)有的基因毒性、致癌性或其他測(cè)試物質(zhì)的毒性數(shù)據(jù)在調(diào)查之中。應(yīng)考慮的重要因素應(yīng)包括給藥途徑、預(yù)測(cè)的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗(yàn)物質(zhì)可能的作用機(jī)制。肝臟是研究最頻繁、數(shù)據(jù)最豐富的組織。因此，在缺乏任何背景信息的情況下，如果沒有確定感興趣的特定組織，那么對(duì)肝臟進(jìn)行取樣是合理的，因?yàn)楦闻K是異種生物代謝的主要場(chǎng)所，而且常常高度暴露于母體物質(zhì)和代謝物中。在某些情況下，直接接觸部位的檢查(例如，口服藥物，胃腺或十二指腸/空腸，或吸入藥物，肺)可能是最相關(guān)的。應(yīng)根據(jù)進(jìn)行測(cè)試的具體原因選擇其他或替代組織，但如果實(shí)驗(yàn)室已證明對(duì)這些組織的熟練程度和同時(shí)處理多個(gè)組織的能力，對(duì)同一動(dòng)物的多個(gè)組織進(jìn)行檢查可能是有用的。
樣本制備：在最后一次用測(cè)試化學(xué)品后的適當(dāng)時(shí)間，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死。收集選定的組織,而同時(shí)采集同一組織的一部分,放置在甲醛溶液或適當(dāng)?shù)墓潭▌┛赡芙M織病理學(xué)分析。彗星實(shí)驗(yàn)的組織被放置在切碎緩沖液中，用冷切碎緩沖液充分沖洗以去除殘留的血液，并儲(chǔ)存在冰冷的切碎緩沖液中，直到處理完畢。原位灌注也可進(jìn)行，如肝、腎灌注。
玻片準(zhǔn)備：單細(xì)胞懸液制備后，應(yīng)盡快(最好在1小時(shí)內(nèi))制備載玻片，但動(dòng)物死亡與載玻片制備之間的溫度和時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行驗(yàn)證。向低熔點(diǎn)瓊脂糖(通常0.5-1.0%)中加入細(xì)胞懸浮液的體積，使玻片的低熔點(diǎn)瓊脂糖百分比不應(yīng)降低到0.45%以下。最佳的細(xì)胞密度將由用來給彗星評(píng)分的圖像分析系統(tǒng)決定。
細(xì)胞裂解：裂解條件也是一個(gè)關(guān)鍵變量，可能會(huì)干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導(dǎo)致的鏈斷裂。因此，我們建議在實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準(zhǔn)備好后，應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(shí)(或過夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。也可以使用電泳緩沖液。這將維持電泳室的堿性條件。
解旋和電泳：將載玻片隨機(jī)放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺(tái)上，使載玻片表面完全覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。在其他類型的彗星試驗(yàn)電泳裝置，即主動(dòng)冷卻，循環(huán)和高容量電源，較高的解決方案覆蓋將導(dǎo)致更高的電流，而電壓保持不變。
測(cè)量方法：彗星應(yīng)該使用自動(dòng)化或半自動(dòng)化的圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量評(píng)分。用合適的熒光染色劑對(duì)載玻片進(jìn)行染色，并在配備有超熒光和適當(dāng)檢測(cè)器的顯微鏡或數(shù)碼相機(jī)上進(jìn)行適當(dāng)放大(如200x)的測(cè)量。
根據(jù)彗星圖像圖譜的描述，細(xì)胞可以分為三種類型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的細(xì)胞(明確定義的頭部和尾部，不干擾相鄰的細(xì)胞)應(yīng)該為%的尾部DNA，以避免人為干擾。刺猬的頻率應(yīng)該根據(jù)每個(gè)樣本至少150個(gè)細(xì)胞的視覺評(píng)分(因?yàn)槿鄙僖粋�(gè)清晰定義的頭部意味著它們不容易被圖像分析檢測(cè)到)來確定，并單獨(dú)記錄下來。
所有用于分析的玻片，包括陽性和陰性對(duì)照的玻片，都應(yīng)獨(dú)立編碼并進(jìn)行“盲法”評(píng)分，以便評(píng)分者不知道情況。對(duì)于每個(gè)樣本(每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)組織)，至少應(yīng)該分析150個(gè)細(xì)胞(刺猬除外)。分析150細(xì)胞/動(dòng)物至少5動(dòng)物每劑，提供足夠的統(tǒng)計(jì)能力。
彗星DNA鏈斷裂可以通過尾DNA %、尾長和尾力矩等獨(dú)立端點(diǎn)來測(cè)量。如果使用適當(dāng)?shù)膱D像軟件分析儀系統(tǒng)，就可以進(jìn)行這三種測(cè)量。然而，推薦將%尾DNA(也稱為%尾強(qiáng)度)用于結(jié)果的評(píng)估和解釋，并由以細(xì)胞總強(qiáng)度百分比表示的尾DNA片段強(qiáng)度決定。
數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
在實(shí)驗(yàn)條件下，陽性對(duì)照組的尾DNA%的與陰性對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加（p<0.05）時(shí)，判定試驗(yàn)系統(tǒng)有效。
在試驗(yàn)系統(tǒng)判定有效的前提下，同時(shí)滿足以下三個(gè)條件，則判定受試樣品為陽性結(jié)果：
（1） 尾DNA%的在某個(gè)單獨(dú)劑量組顯著升高；
（2） 尾DNA%隨試驗(yàn)樣品濃度升高有顯著增加趨勢(shì)；
（3） 受試物組的尾DNA%全部超過陰性背景數(shù)據(jù)范圍。
在判定陽性結(jié)果時(shí)，如僅符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或兩個(gè)，除統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，還應(yīng)考慮其生物學(xué)意義。
如全部不符合上述3個(gè)，則判定為陰性結(jié)果。
 
彗星試驗(yàn)試劑盒
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)堿性彗星試驗(yàn)開發(fā)試劑盒，本試劑盒省去了試驗(yàn)溶劑配制、溶膠配制不穩(wěn)定等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，符合堿性彗星試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。堿性彗星試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。
 
【產(chǎn)品說明】
    本試劑盒提供了單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)需要的試劑和耗材。
試劑名稱 規(guī)格 數(shù)量 儲(chǔ)存條件
 

包裝盒	產(chǎn)品組成	規(guī)格	數(shù)量	保存條件
堿性彗星實(shí)驗(yàn)盒	細(xì)胞裂解液	500 mL	1	室溫
	電泳膠A	10 mL	1	室溫
	電泳膠B	15 mL	1	4℃
	玻片	2孔	30	室溫
	200 mM EDTA, PH 10	12.5mL	1	室溫
	核酸染料	10 ul	1	4℃
	DMSO	50 mL	1	室溫

• 細(xì)胞裂解液避免了多成分配制的繁瑣工藝，保證了每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解的穩(wěn)定性。
• 電泳膠經(jīng)過采用先進(jìn)工藝規(guī)�；�制備，出廠前經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接溶解即可使用。
• 針對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩孔式玻片增加了溶膠的粘附性，使細(xì)胞完整，便于拍照分析。

【試劑盒應(yīng)用范圍】
本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。
【傳統(tǒng)試驗(yàn)操作不足】

• 溶液配制繁瑣，每次配制裂解效果不同。
• 不同膠濃度會(huì)影響DNA尾百分?jǐn)?shù)，過低濃度的膠穩(wěn)定性差，過高濃度的膠會(huì)抑制彗星尾的產(chǎn)生，且反復(fù)溶膠會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)備液蒸發(fā)，影響試驗(yàn)結(jié)果。
• 傳統(tǒng)玻片對(duì)溶膠的粘附性較低，且溶膠易流出玻片，損失較大。

【試劑盒優(yōu)勢(shì)】
便捷——匯智泰康彗星試驗(yàn)試劑盒省去了裂解液配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
準(zhǔn)確——匯智泰康彗星試驗(yàn)試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定——匯智泰康彗星試驗(yàn)試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。