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m6A修飾的YTHDF1與介導EIF3C對卵巢癌進展的影響

瀏覽次數：1576　發(fā)布日期：2020-3-4　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

文章導讀

m6A是真核生物中最常見的一類RNA修飾，能夠在多種生物過程中發(fā)揮重要作用，例如癌癥發(fā)生發(fā)展、細胞分化、壓力應答、免疫反應以及神經發(fā)育等。2019年m6A修飾曾創(chuàng)下單月發(fā)表100+篇10分影響因子的輝煌。2020年1月何川教授團隊再次帶領m6A登上頂級期刊Science，預示著m6A等RNA修飾將繼續(xù)引領新一年的科研熱點。

目前大部分研究主要探究m6A對蛋白編碼基因的調控——即影響mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。2020年1月30日高分期刊Nucleic Acids Research上再次發(fā)表論文，證實 m6A閱讀器YTHDF1能夠增強EIF3C的翻譯促進其表達，進而加強卵巢癌細胞整體翻譯水平，促進卵巢癌的惡性進展。

原文鏈接：The m6A reader YTHDF1 promotes ovarian cancer progression via augmenting EIF3C translation
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：11.147
發(fā)表日期：20200130
運用技術：RNA-seq、MeRIP-seq、RIP-seq和RIP-qPCR等（云序提供以上服務）

文章內容

1.YTHDF1在卵巢癌中高表達

為了研究m6A在卵巢癌發(fā)展中的作用，作者首先使用TCGA數據集分析了m6A相關的酶在卵巢癌中的遺傳變異和表達水平，其中YTHDF1基因擴增最頻繁且其表達顯著升高。接著，作者根據兩個GEO數據集（GSE66957和GSE54388）分析了YTHDF1在卵巢癌中的表達，發(fā)現與正常卵巢上皮細胞相比，YTHDF1在卵巢癌中表達上調。

圖1 YTHDF1在卵巢癌中高表達

2. YTHDF1調節(jié)卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲

為了探索YTHDF1在卵巢癌中的功能，作者沉默YTHDF1后檢測卵巢癌細胞的表型。通過CCK8分析發(fā)現，YTHDF1的沉默顯著影響了A2780和SKOV3卵巢癌細胞的生長。此外，EdU染色表明，在YTHDF1沉默后，卵巢癌細胞的增殖顯著降低。同樣，克隆形成實驗克隆形成實驗表明，敲除YTHDF1后細胞的生成能力受到抑制。此外，細胞遷移和侵襲實驗表明，YTHDF1沉默會降低細胞的遷移和侵襲能力。這些結果：表明，YTHDF1在卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起重要作用。

圖2 YTHDF1調節(jié)卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲

3. YTHDF1沉默抑制體內卵巢癌細胞的發(fā)生和轉移

為了評估YTHDF1在體內卵巢癌中的致癌作用，作者應用了小鼠裸鼠成瘤實驗進行了探究。首先，將YTHDF1缺陷型A2780卵巢癌細胞和對照細胞分別皮下注射到裸鼠中。4周后，處死小鼠并分離腫瘤。源自YTHDF1缺陷型組的腫瘤明顯小于對照組。同時，與對照小鼠相比，具有YTHDF1基因敲低的小鼠的平均腫瘤體積和處死時的重量明顯降低。作者還評估了這些實體瘤中的細胞增殖和凋亡指數。與對照細胞相比，YTHDF1沉默的腫瘤中Ki-67信號降低，caspase-3活性增加。注射YTHDF1沉默細胞，可大大消除細胞在腹腔內形成繼發(fā)性腫瘤的能力。這些結果共同證明了YTHDF1在卵巢癌中的致癌作用是通過調節(jié)細胞增殖和轉移來實現的。

圖3 在卵巢癌中YTHDF1通過調節(jié)細胞增殖和轉移致癌

4. 尋找YTHDF1靶基因--EIF3C

為了探索YTHDF1在卵巢癌發(fā)展中的潛在機制，作者分別對YTHDF1敲除和對照組的A2780細胞進行了RNA-seq（云序提供此服務）。分析結果發(fā)現了1715個差異表達的基因，包括633個上調基因和1082個下調基因。同時，作者對過表YTHDF1的A2780細胞分別進行了m6A-seq和RIP-seq（云序提供此服務）。通過m6A-seq分析，作者從3990個基因中鑒定出8104個m6A峰，這些m6A修飾主要位于mRNA中（91％），并在終止密碼子附近富集。RIP-seq揭示了1698個潛在的YTHDF1候選靶基因，其中93％是mRNA。RNA-seq、m6A-seq和RIP-seq取交集后發(fā)現，與YTHDF1結合的693個基因被m6A標記，其中647個（93.4％）基因表達未發(fā)生改變。這些結果表明YTHDF1不會影響其靶基因的RNA豐度，與前人研究一致。此外，功能注釋顯示這647個基因參與了多個RNA代謝過程，包括翻譯、mRNA剪接和RNA穩(wěn)態(tài)。

為了全面探索YTHDF1及其靶基因之間的直接相互作用，作者對過表YTHDF1的A2780細胞，進行了eCLIP-seq，并鑒定了2,343個目標轉錄物，這些轉錄物大多數是mRNA。將eCLIP seq的結果2,343個基因和上面三組數據交集確定的647個基因取交集，產生175個基因，將其確定為YTHDF1的直接結合靶基因。接下來，作者分析了175個基因上，m6A峰和YTHDF1結合mRNA上的eCLIP峰的分布。作者發(fā)現這些轉錄本中的大多數YTHDF1結合位點（包括EIF3C）都與m6A位點非常吻合。GO分析表明，結合YTHDF1的轉錄本與翻譯調控最密切相關。EIF3C是真核轉錄起始因子EIF3的亞基之一，其翻譯控制有助于腫瘤發(fā)生。此外，EIF3C與多種癌癥（包括肝細胞癌，結腸癌和乳腺癌）的惡性行為相關。CLIP-qPCR還顯示YTHDF1最顯著富集EIF3C mRNA。這些數據表明EIF3C是YTHDF1在卵巢癌細胞中的直接靶標。

圖4 YTHDF1靶基因鑒定m6A測序數據展示

5. YTHDF1調節(jié)卵巢癌細胞中EIF3C的表達和整體蛋白合成

為了確認YTHDF1調節(jié)卵巢癌細胞中EIF3C的表達，作者沉默YTHDF1后，探究了EIF3C的轉錄和翻譯水平。如預期的那樣，YTHDF1沉默可降低EIF3C的蛋白質豐度，而不會影響EIF3C的mRNA水平。接著，利用RIP-qPCR（云序提供此服務）證實了YTHDF1和EIF3C mRNA之間的相互作用。然后，作者針對YTHDF1和EIF3C mRNA的結合位點設計突變（YTHDF1-mut），RIP-qPCR發(fā)現YTHDF1突變體與EIF3C mRNA之間的相互作用顯著降低。蛋白質印跡分析顯示，YTHDF1-wt可以增強EIF3C的表達。
由于EIF3C是蛋白質合成所必需的EIF3復合物的關鍵亞基，因此作者接下來探討了YTHDF1是否會影響卵巢癌細胞的整體蛋白合成。為了測試這一點，作者使用HPG摻入法分析新蛋白質的合成。與對照細胞相比，EIF3C敲低后摻入到合成蛋白中的HPG在下降。同樣，與對照細胞相比，YTHDF1沉默的細胞也顯示HPG信號下降，這表明YTHDF1可以影響整體蛋白質合成�？偟膩碚f，這些數據表明YTHDF1通過調節(jié)卵巢癌細胞中的EIF3C蛋白表達來影響整體蛋白合成。

圖5 YTHDF1以m6A依賴性方式調節(jié)EIF3C翻譯

6. 回補EIF3C可改善YTHDF1沉默對卵巢癌細胞的抑癌作用

作者檢測卵巢癌組織中EIF3C的蛋白表達，發(fā)現EIF3C在卵巢癌中的蛋白表達顯著升高。

EIF3C敲低后，細胞生長、集落形成能力、細胞遷移和侵襲均受到明顯抑制。這些結果表明，EIF3C促進了卵巢癌的腫瘤發(fā)生。接著，作者在沉默YTHDF1的A2780和SKOV3細胞中過表達EIF3C，YTHDF1沉默會抑制細胞生長、集落形成、細胞遷移和侵襲，而EIF3C的回補則可以逆轉這種抑制作用。這些結果表明，EIF3C是YTHDF1促進卵巢癌進展的關鍵下游靶標。最后，作者分析了卵巢癌組織中EIF3C蛋白表達與YTHDF1蛋白表達之間的相關性，發(fā)現YTHDF1的蛋白質豐度與EIF3C的表達呈正相關。以上結果顯示，YTHDF1表達增加可以調節(jié)EIF3C翻譯進而增強整體蛋白質合成，并促進卵巢癌細胞的腫瘤發(fā)生。

圖6 YTHDF1依賴EIF3C促進卵巢癌細胞的生長和遷移

總結：

M6A甲基化是哺乳動物mRNA中含量最豐富的RNA修飾，越來越多的證據表明m6A在人類腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用。本文，作者利用RNA-seq、MeRIP-seq和RIP-seq等多種技術聯合分析，發(fā)現甲基化識別蛋白YTHDF1的直接靶點--蛋白質翻譯起始因子eIF3的一個亞基EIF3C。YTHDF1通過與m6A修飾的EIF3C mRNA結合，以m6A依賴的方式增加EIF3C的翻譯，同時促進整體蛋白合成，從而促進卵巢癌的發(fā)生和轉移。本文確定了對卵巢癌進展至關重要的新的YTHDF1-EIF3C軸，為開發(fā)癌癥治療提供新的靶點。

圖7 YTHDF1介導的EIF3C翻譯在卵巢癌中的作用

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