睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LCs）m6A修飾提供新治療靶點(diǎn)在不育癥治療方向的應(yīng)用

2020年1月31日，m6A調(diào)節(jié)睪酮合成一文發(fā)表在Autophagy （IF=11.059）期刊上，該文章采用多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LCs）m6A甲基化修飾，這項(xiàng)研究揭示m6A 甲基化在LCs中調(diào)節(jié)睪酮合成中的作用，通過(guò)利用m6A 甲基化研究作為無(wú)精子癥和少精子癥的治療靶點(diǎn)，為新的治療策略提供了方向。

發(fā)表期刊：Autophagy
影響因子：11.059
發(fā)表時(shí)間：20200131
實(shí)驗(yàn)方法：MeRIP-seq, RNA-seq,CoIP, ChIP, RIP, MeRIP-qPCR等（云序生物提供此服務(wù)）
原文鏈接：m6A mRNA methylation regulates testosterone synthesis through modulating autophagy in Leydig cells

1.自噬對(duì)LCs中睪酮的合成至關(guān)重要

本研究中作者檢測(cè)了LCs自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B-II，發(fā)現(xiàn)LCs中LC3B-II在細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)增加，并且在成年人LCs中達(dá)到峰值。此外LC3B-II在LCs從莖細(xì)胞向成體細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)量增加，同時(shí)血清睪酮水平逐漸升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默ATG7后抑制HsCG誘導(dǎo)LC3B-II表達(dá)和睪酮分泌，表明LCs自噬介導(dǎo)睪酮合成。

圖1. LCs自噬介導(dǎo)睪酮合成

2.LCs的自噬依賴(lài)于AMPK信號(hào)通路

為了探究LCs自噬過(guò)程參與的信號(hào)通路，根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)磷酸化AMPK亞基PRKAA2 Thr172是自噬過(guò)程中典型的啟動(dòng)者，并且可以增加其下游蛋白p-ULK1 Ser555的表達(dá)，本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在LCs從莖細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的過(guò)程中，細(xì)胞中p-RKAA2 Thr172和p-ULK1 Ser555水平穩(wěn)定升高，而且AMPK抑制劑有效抑制HsCG誘導(dǎo)LC3B-II增加，并減少PRKAA2 Thr172和ULK1 Ser555的磷酸化，這些結(jié)果證實(shí)了LCs自噬誘導(dǎo)依賴(lài)于AMPK信號(hào)通路。

圖2. LCs的自噬依賴(lài)于AMPK信號(hào)通路

3.CAMKK2/PPM1A參與PRKAA2 Thr172磷酸化過(guò)程

為了探究在LCs中HsCG誘導(dǎo)p-PRKAA2 Thr172 增強(qiáng)表達(dá)的機(jī)制，作者檢測(cè)了兩種經(jīng)典的磷酸化激酶CAMKK2和STK11/LKB1以及去磷酸化酶PPM1A，數(shù)據(jù)顯示HsCG可以誘導(dǎo)的CAMKK2表達(dá)增加和PPM1A的表達(dá)減少，此外，TM3細(xì)胞和初級(jí)LCs在CAMKK2敲低或者過(guò)表達(dá)PPM1A后，明顯抑制了HsCG誘導(dǎo)增加LC3B-II的表達(dá)、AMPK活化和降低SQSTM1的表達(dá)。

圖3. CAMKK2/PPM1A參與PRKAA2 Thr172磷酸化過(guò)程

4. LCs中的睪酮合成受m6A mRNA修飾調(diào)控

根據(jù)前期研究數(shù)據(jù)顯示m6A修飾可以參與胚胎發(fā)育，那么是否也能夠影響LCs發(fā)育呢？作者利用比色法檢測(cè)整體甲基化水平（云序生物提供此服務(wù)），發(fā)現(xiàn)在LCs發(fā)育過(guò)程中m6A整體水平逐漸下降，同時(shí)ALKBH5（Eraser）和FTO(Eraser)表達(dá)逐漸增加和METTL14(Writer)表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步研究m6A修飾在LCs發(fā)育調(diào)控中的重要作用，作者還檢測(cè)了無(wú)精子癥或少精子癥患者體內(nèi)LCs中m6A的甲基化水平，實(shí)驗(yàn)表明這些患者體內(nèi)的甲基化水平升高了，并且m6A和HSD3B（睪酮合成能力檢測(cè)）呈負(fù)相關(guān)，提示m6A修飾可能介導(dǎo)LCs中睪酮的合成。

圖4. LCs中的睪酮合成受m6A mRNA修飾調(diào)控

5.m6A甲基化影響Camkk2 RNA的穩(wěn)定性

既然m6A能夠影響AMPK信號(hào)通路的激活，那么m6A修飾是否作用于Cammkk2呢？作者通過(guò)MeRIP-qPCR(云序生物提供此服務(wù))技術(shù)證實(shí)Cammkk2存在2個(gè)甲基化修飾位點(diǎn)，同時(shí)經(jīng)過(guò)HsCG處理后甲基化水平明顯下降，并且利用RIP（云序生物提供此服務(wù)）實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)Cammkk2與YTHDF2(Reader)緊密結(jié)合，這也證實(shí)了m6A修飾降低Camkk2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖5. m6A甲基化影響Camkk2 RNA的穩(wěn)定性

6. m6A甲基化促進(jìn)Ppm1a的翻譯

作者觀察到Y(jié)THDF1（Reader）或METTL14敲除后LCs中PPM1A的表達(dá)降低，但是Ppm1a mRNA的水平?jīng)]有明顯變化，有可能是蛋白穩(wěn)定性或者翻譯效率導(dǎo)致Ppm1a蛋白表達(dá)下降。利用蛋白翻譯抑制劑CHX處理LCs，觀察METTL14敲除與未敲除后PPM1A在LCs中的降解速率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HsCG降低了Ppm1a的表達(dá)，而敲除ALKBH5卻沒(méi)有；并且RIP（云序生物提供此服務(wù)）實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)PPM1A與YTHDF1緊密結(jié)合，同時(shí)CoIP(云序生物提供此服務(wù))分析表明HsCG處理后促進(jìn)了YTHDF1與EIF3A（真核翻譯起始因子3）和EEF2(真核翻譯起始因子2)結(jié)合,這些結(jié)果都說(shuō)明m6A只是通過(guò)調(diào)節(jié)PPM1A的翻譯而不是影響蛋白的穩(wěn)定性。作者利用MeRIP-qPCR(云序生物提供此服務(wù))進(jìn)一步探討Ppm1a甲基化位點(diǎn)信息，發(fā)現(xiàn)Ppm1a存在5個(gè)甲基化修飾位點(diǎn)，并且位于3’U 區(qū)域甲基化位點(diǎn)能夠促進(jìn)Ppm1a的翻譯。

圖6. m6A甲基化促進(jìn)Ppm1a的翻譯

7. HsCG對(duì)METTL14/ALKBH5的影響

研究發(fā)現(xiàn)HsCG通過(guò)誘導(dǎo)METTL14降解降低其表達(dá)，并且通過(guò)提高ALKBH5轉(zhuǎn)錄水平增加ALKBH5的表達(dá)，而CHIP實(shí)驗(yàn)（云序生物提供此服務(wù)）也證實(shí)HsCG誘導(dǎo)促進(jìn)TFEB和CEBPB與ALKBH5啟動(dòng)子的結(jié)合從而提高其轉(zhuǎn)錄水平，增加ALKBH5的表達(dá)。

圖7. HsCG對(duì)METTL14/ALKBH5的影響

總結(jié)：

 細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化依賴(lài)于基因的調(diào)控表達(dá)方式，越來(lái)越多的研究表明m6A 甲基化在更多領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而本文作者正是利用多組學(xué)MeRIP, RIP, CoIP, CHIP（云序生物提供此服務(wù)）等多種技術(shù)聯(lián)合分析，揭示了m6A修飾通過(guò)影響Camkk2轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性和Ppm1a的翻譯效率調(diào)節(jié)LCs自噬從而影響睪酮的合成，該研究不僅利用m6A RNA甲基化作為治療血清睪酮水平降低無(wú)精子癥或者低精子癥患者的靶點(diǎn)提供了新的治療策略，還為m6A RNA甲基化功能機(jī)制研究提供了新的方向，有望作為治療“不孕不育”的新思路。m6A甲基化始終作為近來(lái)科研熱點(diǎn)，相信此次m6A新領(lǐng)域新方向的發(fā)現(xiàn)將會(huì)聚焦更多的目光，云序生物一直以來(lái)致力于RNA修飾測(cè)序服務(wù)，能夠快捷高效助你開(kāi)拓RNA修飾新“市場(chǎng)”，此時(shí)不出手更待何時(shí)。更多咨訊請(qǐng)電話熱線直撥，云序RNA甲基化修飾專(zhuān)家給您全方位解答。

圖8. m6A通過(guò)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的自噬調(diào)節(jié)睪酮的合成

云序生物RNA修飾特色

*云序生物作為國(guó)內(nèi)最早做m6A的科研平臺(tái)，至今用戶(hù)已發(fā)表10多篇m6A相關(guān)文章，其中多篇影響因子超過(guò)10分。

*云序生物RNA修飾高通量測(cè)序產(chǎn)品覆蓋面廣，包括編碼mRNA和非編碼lncRNA，circRNA，microRNA等分子。云序生物既提供針對(duì)單個(gè)分子的m6A測(cè)序，也提供一次檢測(cè)多種RNA分子m6A修飾的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

*公司長(zhǎng)期致力于提供優(yōu)質(zhì)前沿表觀研究測(cè)序產(chǎn)品，結(jié)合最新科研熱點(diǎn)繼m6A、m5C、m1A之后，隆重推出多款RNA新修飾，不僅有m7G測(cè)序，還包括m3C測(cè)序、ac4C乙�；瘻y(cè)序和2'-O-甲基化測(cè)序，打造了全修飾和全分子覆蓋的研究平臺(tái)。

云序生物國(guó)內(nèi)獨(dú)家提供RNA修飾測(cè)序一站式服務(wù)

云序生物提供比色法檢測(cè)整體m6A修飾水平、RNA修飾測(cè)序、MeRIP-qPCR驗(yàn)證、RIP和RNA pull-down機(jī)制等研究服務(wù)。2016年至今，檢測(cè)樣本數(shù)量累積超過(guò)5000+，MeRIP富集成功率高達(dá)98%以上。為解決客戶(hù)樣本量少的問(wèn)題，云序早已經(jīng)推出超微量MeRIP測(cè)序技術(shù)，500ng總RNA即可完成測(cè)序。特殊樣本如血清，血漿，外泌體和石蠟等也可進(jìn)行RNA修飾測(cè)序。

云序生物m6A RNA甲基化測(cè)序技術(shù)服務(wù)流程：

利用m6A特異性抗體，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)（MeRIP方法）特異性富集發(fā)生甲基化修飾的RNA，與不處理組（Input）做對(duì)比，對(duì)m6A修飾進(jìn)行高通量測(cè)序和peak峰定位。 

云序優(yōu)勢(shì)： 
國(guó)內(nèi)10分RNA甲基化文章平臺(tái)
率先實(shí)現(xiàn)超微量技術(shù)，低至500ng
全分子覆蓋（circRNA,lncRNA,mRNA等）
全物種覆蓋（動(dòng)物、植物全覆蓋）

云序生物您身邊的RNA修飾測(cè)序?qū)＜遥?/strong>