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去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中的應用

瀏覽次數(shù)：1282　發(fā)布日期：2020-7-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

文章導讀

表觀遺傳修飾如m6A甲基化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。而甲基化酶對ai癥的影響也受到廣泛關注。其中去甲基化酶ALKBH5已被報道過能通過維持乳腺ai細胞的干細胞性而促進腫瘤的形成，還有文章探究過其在急性白血病中的作用，但其對胰腺ai的影響還缺乏研究。今年5月份發(fā)表在Molecular Cancer (IF=15) 上的文章RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner揭示了去甲基化酶ALKBH5通過調(diào)控m6A修飾調(diào)節(jié)PER1的轉(zhuǎn)錄后激活，發(fā)揮對胰腺ai抑制作用。

RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner

發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時間：2020.5.19
實驗方法: m6A-seq, RNA-seq,MeRIP-qPCR, ChIP, CoIP, 雙熒光素酶實驗
文章鏈接：RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner

研究內(nèi)容
1.ALKBH5降低對胰腺ai的指示意義
首先為了探究去甲基化酶ALKBH5在胰腺ai中的表達和臨床意義，作者對42個胰腺ai患者的腫瘤和臨近組織做了qPCR和免疫染色，發(fā)現(xiàn)腫瘤中ALKBH5的表達明顯降低，mRNA的m6A水平升高。加上對數(shù)據(jù)庫中177個胰腺ai患者生存率的分析發(fā)現(xiàn) ALKBH5低表達與總生存率的降低具有相關性。這些結果初步顯示了ALKBH5表達對胰腺ai的預測和預后具有指示意義。

2.ALKBH5降低對胰腺ai細胞轉(zhuǎn)錄組水平的影響
接著，作者對3個過表達ALKBH5的胰腺ai細胞樣品和3個對照胰腺ai細胞樣品進行了RNA-seq（云序提供服務），發(fā)現(xiàn)過表達的ALKBH5的細胞中，前15個上調(diào)基因包括了 PER1, FOXO1, CDC20, 和CCR5等，GO分析顯示上調(diào)的基因富集在細胞周期終止、抗增殖和細胞凋亡等功能，而下調(diào)的基因富集在細胞增殖和存活相關功能條目中，KEGG分析顯示富集的通路中含有細胞周期和生長的相關的通路p53信號通路和 PI3K-AKT信號通路。這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示ALKBH5具有抑制胰腺ai的功能。

3.ALKBH5抑制胰腺ai細胞增殖、遷移和侵襲
作者通過細胞表型實驗進一步驗證ALKBH5對胰腺ai細胞的影響。通過轉(zhuǎn)染手段，發(fā)現(xiàn)對胰腺ai細胞進行ALKBH5過表達能導致細胞增值降低，而敲降ALKBH5會導致細胞增值速率上升。細胞群落形成實驗和流式細胞儀分析顯示了相同結果。并且過表達ALKBH5抑制傷口閉合和ai細胞侵襲能力。

4.ALKBH5抑制胰腺ai細胞生長和轉(zhuǎn)移
將過表達ALKBH5的ai細胞移植到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)過表達ALKBH5的ai細胞生成的腫瘤體積明顯小于對照組，并且細胞生長的指示分子Ki-67的表達也明顯降低。染色顯示過表達ALKBH5的組織中侵襲和轉(zhuǎn)移的指示分子MMP-2和MMP-9表達降低，敲降ALKBH5的組織中兩分子則升高。原位和異種移植模型中都得到了相似的結果。

5.ALKBH5作用于PER1調(diào)控胰腺ai細胞
作者通過ELISA發(fā)現(xiàn)過表達ALKBH5的細胞中m6A整體水平下降。于是通過m6A-seq（云序提供服務）進一步尋找去甲基化酶可能作用的靶基因。比較過表達ALKBH5的細胞，對照細胞中發(fā)現(xiàn)了7226個特有的甲基化位點，其中應含有ALKBH5作用的基因。通過對RNA-seq和m6A-seq（云序提供服務）兩組學聯(lián)合分析，篩選出78個表達和甲基化水平都明顯差異的基因，再與7226個對照組特有甲基化位點所在的基因取交集，篩選出9個基因。再結合可視化，鎖定了3’UTR區(qū)有明顯m6A峰的基因PER1。

6.缺少ALKBH5引發(fā)m6A識別蛋白YTHDF2誘導的mRNA降解，導致PER1的mRNA水平降低
qPCR顯示ALKBH5過表達細胞中PER1表達升高，ALKBH5敲降細胞中PER1表達降低, 表明ALKBH5可調(diào)控PER1表達。MeRIP-qPCR（云序提供服務）則驗證了過表達ALKBH5降低PER1的m6A水平。雙熒光素酶實驗（云序提供服務）進一步驗證了ALKBH5作用在mRNA上的motif序列并能調(diào)控PER1的表達水平。另外由于PER1 mRNA上m6A位點與識別蛋白YTHDF2的結合位點臨近，作者進行了敲降實驗，發(fā)現(xiàn)敲降YTHDF2也能導致PER1 mRNA水平升高。這些結果表明，ALKBH5的敲降，導致PER1 mRNA的m6A水平升高，進而被YTHDF2識別增強了mRNA降解。

7.PER1抑制胰腺ai細胞
為了驗證PER1對胰腺ai的影響，作者首先通過qPCR驗證了42個患者的腫瘤組織中PER1表達降低。生存分析顯示PER1低表達和總生存率的降低有相關性，并且對TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的分析表明PER1表達與ALKBH5水平正相關。CCK-8, EdU 和 transwell實驗驗證了PER1異位表達可抑制胰腺ai進展，并部分緩解ALKBH5敲降帶來的細胞增值和侵襲。另外，作者還發(fā)現(xiàn)了回補PER1表達導致 ATM依賴信號通路的重激活，包括p-ATM, p-CHK2, p-CDC25C, p-P53, P21,和p-CDK表達的上升。CoIP（云序提供服務）實驗也驗證了ATM和PER1的相互作用。

8.PER1誘導恢復P53表達增強ALKBH5轉(zhuǎn)錄
作者發(fā)現(xiàn)PER1過表達引起P53升高后，ALKBH5水平也隨之升高，同時免疫染色也顯示整體m6A水平降低。于是為了驗證P53和ALKBH5的關系，通過ChIP實驗和雙熒光素酶實驗（云序提供服務），驗證了P53與ALKBH5的啟動子區(qū)結合，激活ALKBH5的轉(zhuǎn)錄。

總結
本文作者通過RNA-seq, m6A-seq, MeRIP-qPCR, ChIP, CoIP,雙熒光素酶實驗等方法，研究發(fā)現(xiàn)去甲基化酶ALKBH5缺失會加重胰腺ai的發(fā)生和不良臨床病理表現(xiàn)特征。ALKBH5的過度表達可降低了體外腫瘤的增殖、遷移和侵襲活性，改善了體內(nèi)腫瘤生長，而ALKBH5基因敲除可促進胰腺ai的進展。其調(diào)控機制為，ALKBH5調(diào)控m6A去甲基化，減少YTHDF2識別m6A導致的mRNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上激活PER1，PER1上調(diào)導致ATM-CHK2-P53/CDC25C信號的激活，抑制細胞生長。而P53誘導的ALKBH5轉(zhuǎn)錄激活又是對m6A修飾的反饋調(diào)節(jié)。本研究為基于去甲基化的胰腺ai診斷和治療方法提供了基礎。

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