外泌體環(huán)狀RNA作為結(jié)腸ai分子標(biāo)志物的實(shí)例應(yīng)用

文章導(dǎo)讀
如今想要短平快靠單純測(cè)序+驗(yàn)證發(fā)表一篇5分左右文章，光靠一個(gè)熱點(diǎn)環(huán)狀RNA還不夠，環(huán)狀RNA+外泌體，環(huán)狀RNA+m6A，環(huán)狀RNA+環(huán)狀DNA等方向都是可以去嘗試的。小編今 天以云序用戶以環(huán)狀RNA+外泌體作為研究方向的案例進(jìn)行解析。
2020年6月18日云序用戶山大二院在Frontiers in Oncology (IF=4.85)上發(fā)表了一篇題目RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer的文章，該文章通過(guò)運(yùn)用了云序生物外泌體全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探究了環(huán)狀RNA作為結(jié)腸ai分子標(biāo)志物的可能性。
結(jié)腸ai（CRC）是第三大常見(jiàn)惡性腫 瘤，早期CRC患者存活率大 大高于晚期患者，腫 瘤的早期診斷對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要。近年來(lái)有許多研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為廣 泛存在于體液中的一種微囊泡，含有大量DNA、RNA和蛋白等分子，可以反應(yīng)他們來(lái)源細(xì)胞的信息。許多ai細(xì)胞來(lái)源的外泌體內(nèi)的分子具有成為ai癥分子標(biāo)志物的潛力。這其中，環(huán)狀RNA由于其穩(wěn)定性高，被作為多種ai癥的分子標(biāo)志物研究過(guò)。在這篇文章中，作者通過(guò)對(duì)50個(gè)患者和50和健康人血清中外泌體環(huán)狀RNA的研究，提出了其中circ-PNN作為CRC診斷分子標(biāo)志物的可能。

發(fā)表期刊：Frontiers in Oncology
影響因子：4.85
發(fā)表時(shí)間：2020.6.18
實(shí)驗(yàn)方法: 外泌體提取、鑒定、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、circRNA-PCR、circRNA酶耐受、sanger測(cè)序（均由云序一站式提供）
文章鏈接：RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer

研究?jī)?nèi)容
1.環(huán)狀RNA表達(dá)譜
作者將50個(gè)CRC患者和50個(gè)正常人的血清樣品分別隨機(jī)分為5組均勻混樣，對(duì)混樣后的5v5個(gè)樣品進(jìn)行了外泌體全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 檢測(cè)到1924個(gè)環(huán)狀RNA, 來(lái)源基因在各染色體上均有分布，環(huán)狀大部分長(zhǎng)度小于500nt。 2.CRC患者和健康人中環(huán)狀RNA的差異表達(dá)
接著作者篩選出了122個(gè)在CRC與健康人血清外泌體中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，其中100個(gè)明顯上調(diào)，22個(gè)明顯下調(diào)。其中65個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA。 3.差異環(huán)狀RNA的功能預(yù)測(cè)
通過(guò)對(duì)環(huán)狀RNA來(lái)源基因的GO分析預(yù)測(cè)差異環(huán)狀RNA的功能，結(jié)果顯示上調(diào)的環(huán)狀的潛在功能富集在蛋白修飾和細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)相關(guān)功能，高爾基體相關(guān)功能和轉(zhuǎn)錄共激 活子活性相關(guān)功能。此外KEGG分析還找到了這些基因參與的4個(gè)相關(guān)通路。 4.血清外泌體的鑒定
對(duì)從血清中提取的外泌體，通過(guò)電鏡鑒定驗(yàn)證了外泌體形態(tài)，NTA分析檢測(cè)了外泌體粒徑大小，WB驗(yàn)證了外泌體標(biāo)志蛋白CD9和TSG101。 5.Circ-PNN的生物學(xué)結(jié)構(gòu)
作者通過(guò)qPCR驗(yàn)證了circ-PNN的差異表達(dá)，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證了環(huán)狀反式剪切位點(diǎn)的序列，并驗(yàn)證了發(fā)散引物僅能對(duì)環(huán)狀RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA成功擴(kuò)增，而對(duì)基因組DNA擴(kuò)增無(wú)效。酶耐受實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circ-PNN比對(duì)應(yīng)的PNN線性mRNA更穩(wěn)定。 6.標(biāo)志物circRNA分子的驗(yàn)證
作者擴(kuò)大樣本在88個(gè)CRC患者和88個(gè)健康人的血清外泌體RNA中，通過(guò)qPCR驗(yàn)證了circ-PNN的差異表達(dá)。通過(guò)ROC曲線分析對(duì)circ-PNN作為診斷標(biāo)志物的潛力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示circ-PNN的差異表達(dá)與CRC相關(guān)，可能作為早期CRC但不是淋巴轉(zhuǎn)移期的診斷標(biāo)志物。 7.CircRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)和分析

作者建立了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)circ-PNN可能作用的靶基因，并通過(guò)qPCR驗(yàn)證了其中3個(gè)miRNA與circ-PNN的相關(guān)性。對(duì)靶基因的預(yù)測(cè)為未來(lái)研究circ-PNN影響CRC腫 瘤形成提供了方向。

總結(jié)
本文作者通過(guò)外泌體全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、qPCR和Sanger測(cè)序的手段，展示了CRC中circRNA的表達(dá)譜，篩選了差異表達(dá)的circRNA，驗(yàn)證了其中circ-PNN的差異表達(dá)和序列，并在大量樣本中驗(yàn)證了circ-PNN的差異表達(dá)，通過(guò)ROC分析了其作為早期CRC診斷分子標(biāo)志物的可能。通過(guò)circ-PNN與miRNA共表達(dá)分析也為后續(xù)研究外泌體circ-PNN在CRC發(fā)病過(guò)程中的作用提供了線索。

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