ac4C榮登Nature-RNA修飾研究大有可為

RNA修飾是表觀遺傳學(xué)中調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的關(guān)鍵過程，目前對(duì)m6A RNA修飾的研究已進(jìn)行的如火如荼，但除了m6A以外仍有多種RNA修飾類型參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，其中包括m1A、m5C、m7G、2’-O-甲基化修飾以及ac4C乙�；�修飾，在這些領(lǐng)域的研究中也不斷有高 分文章的出現(xiàn)（如表1）。2020年6月17日，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的Schraga Schwartz研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》上發(fā)表了關(guān)于ac4C的研究成果，發(fā)現(xiàn)定量交叉進(jìn)化圖譜揭示了乙�；�修飾在RNA中的動(dòng)態(tài)變化。今 天我們將著重介紹該項(xiàng)研究以及新發(fā)表在《Cell Host &Microbe》上的關(guān)于ac4C乙�；�修飾的文章，從而帶大家把握這一領(lǐng)域的新進(jìn)展。
文章展示
ac4C——定量交叉進(jìn)化圖譜揭示乙�；�修飾在RNA中的動(dòng)態(tài)變化
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：42.778
發(fā)表時(shí)間：2020.06.17
實(shí)驗(yàn)方法：Nucleotide-resolution ac4C sequencing
文章鏈接：Dynamic RNA acetylation revealed by quantitative cross-evolutionary mapping
ac4C是一種古老且高度保守的RNA修飾，存在于tRNA和rRNA上，近期在真核生物mRNA也有相應(yīng)的研究。然而胞苷乙�；�的分布、動(dòng)力學(xué)和功能還有待進(jìn)一步闡明。2020年6月17日，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》發(fā)表了題為“Dynamic RNA acetylation revealed by quantitative cross-evolutionary mapping .”的研究成果，文章中使用N4-乙酰胞苷（ac4C）-seq，這種化學(xué)基因組學(xué)方法在單核苷酸分辨率下對(duì)ac4C進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組范圍的定量。揭示了ac4C乙�；�研究的新進(jìn)展，為闡明這種修飾在生物學(xué)和疾病中的作用提供了技術(shù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
(1) ac4C單核苷酸分辨率測(cè)序

為了定量研究轉(zhuǎn)錄組中的胞苷乙酰化，作者開發(fā)了一種能夠靈敏檢測(cè)ac4C的化學(xué)方法在單核苷酸分辨率上對(duì)ac4C進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組范圍的定量。在前面研究的基礎(chǔ)上，作者發(fā)現(xiàn)ac4C和氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)在酸性條件下反應(yīng)形成還原的N4-乙酰四氫胞苷。與ac4C相比，這種核酸堿基結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄時(shí)錯(cuò)配形成其他脫氧核苷三磷酸(dNTPs)，且可通過cDNA測(cè)序檢測(cè)出來。與之前的化學(xué)反應(yīng)相比，該反應(yīng)顯示出更快的動(dòng)力學(xué)，并導(dǎo)致已知ac4C的錯(cuò)配摻入到rRNA中。關(guān)鍵的是，ac4C在分析前用溫和的堿水解(化學(xué)法脫乙酰化)修飾時(shí)，未觀察到相應(yīng)的突變。將這些化學(xué)反應(yīng)與二代測(cè)序相結(jié)合，促成了ac4C-seq的發(fā)展，形成了一種能夠?qū)�ac4C在單核苷酸分辨率上進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組定量分析的方法。本文中作者報(bào)道了N4-乙酰胞苷測(cè)序ac4C-seq這種用化學(xué)基因組方法在單核苷酸分辨率上對(duì)ac4C進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組定量的應(yīng)用。

圖例1：ac4C-seq流程的示意圖

(2) 古細(xì)菌RNA中檢測(cè)到ac4C修飾的空前水平
作者利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)對(duì)古生超嗜熱菌的總RNA的交叉進(jìn)化分析顯示ac4C濃度很高。基于此，作者應(yīng)用了ac4C-seq定量繪制了在85℃的生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)的柯達(dá)卡蘭的胞苷乙�；瘓D，發(fā)現(xiàn)ac4C的修飾分布于rRNA、tRNA、非編碼(nc) RNA和mRNA并達(dá)到了前所未有的水平。為了了解RNA乙�；�是否是古細(xì)菌極端微生物的共同特征，作者使用了ac4C-seq分析了糠秕熱球菌和熱球菌中的RNA乙�；�修飾水平，結(jié)果表明ac4C在熱球菌的每個(gè)群體中廣 泛存在且在數(shù)百個(gè)不同的位點(diǎn)發(fā)生修飾。此外也驗(yàn)證了在古細(xì)菌熱球菌中ac4C不僅廣 泛存在，而且ac4C發(fā)生的的位置也高度保守。這些研究確定了古生序熱球菌中普遍存在的RNA乙�；�及其調(diào)控機(jī)制。

圖例2：ac4C在不同古細(xì)菌物種中的ac4C修飾水平

(3)古細(xì)菌RNA乙�；�的動(dòng)態(tài)變化
為了研究ac4C是如何被環(huán)境影響，作者使用ac4C-seq鑒定了在55-95℃的環(huán)境下培養(yǎng)的科柯達(dá)卡蘭菌種乙酰化修飾水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ac4C在溫度升高時(shí)被明顯誘導(dǎo)，而缺乏乙酰轉(zhuǎn)移酶的古細(xì)菌菌株表現(xiàn)出溫度依賴的生長(zhǎng)缺陷。此外，冷凍電子顯微鏡觀察野生型和缺乏乙酰轉(zhuǎn)移酶的古細(xì)菌核糖體的結(jié)果也為ac4C的溫度依賴性分布及其潛在的熱適應(yīng)作用提供了結(jié)構(gòu)上的證據(jù)。作者的研究也定量地顯示了ac4C修飾的整體水平，為闡明這種修飾在生物學(xué)和疾病中的作用提供了技術(shù)和概念基礎(chǔ)。

圖例3：不同溫度處理古細(xì)菌時(shí)ac4C修飾水平的動(dòng)態(tài)變化

ac4C——胞苷殘基乙酰化通過增加病 毒RNA的穩(wěn)定性促進(jìn)HIV-1基因的表達(dá)
發(fā)表期刊：Cell Host &Microbe
影響因子：15.923
發(fā)表時(shí)間：2020.08.12  
實(shí)驗(yàn)方法：ac4C RNA乙�；瘻y(cè)序
文章鏈接：Acetylation of Cytidine Residues Boosts HIV-1 Gene Expression by Increasing Viral RNA Stability
表轉(zhuǎn)錄組RNA修飾，包括腺嘌呤和胞苷殘基的甲基化，被認(rèn)為是細(xì)胞和病 毒mRNA功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，近期有報(bào)道稱ac4C可以增加細(xì)胞mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。2020年8月12日，杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Bryan團(tuán)隊(duì)與北卡羅來納大學(xué)Ronald團(tuán)隊(duì)在《Cell Host & Microbe》上發(fā)表了ac4C在HIV-1病 毒感 染中的重要作用的研究，本文中作者認(rèn)為ac4C以及N -乙酰轉(zhuǎn)移酶10 (NAT10)會(huì)被人類免疫缺陷病 毒1 (HIV-1)破壞以增加病 毒基因表達(dá)。HIV-1轉(zhuǎn)錄本能在多個(gè)離散位點(diǎn)被ac4C修飾，這些ac4C位點(diǎn)的沉默突變導(dǎo)致HIV-1基因表達(dá)下降。同樣，NAT10缺失導(dǎo)致的病 毒轉(zhuǎn)錄本ac4C缺失通過降低病 毒RNA的穩(wěn)定性抑 制了HIV-1的復(fù)制。有趣的是，NAT10抑 制劑在濃度對(duì)細(xì)胞活力沒有影響的情況下，可以抑 制HIV-1的復(fù)制，因此添加ac4C修飾將成為抗病 毒藥物開發(fā)的潛在方向。該研究為HIV的治 療提供了潛在的新靶點(diǎn)，也為深入了解表觀轉(zhuǎn)錄組提供了方法學(xué)的指導(dǎo)。 (1)HIV-1上依賴于NAT10的ac4C修飾
作者首先使用ac4C -seq分析了HIV-1轉(zhuǎn)錄本和來自CEM細(xì)胞和初級(jí)CD4+ T細(xì)胞RNA中的乙�；�修飾水平，發(fā)現(xiàn)ac4C位點(diǎn)同時(shí)存在于病 毒和細(xì)胞RNA上影響mRNA穩(wěn)定性，因此研究者通過分析HIV表達(dá)來間接反映ac4C修飾對(duì)病 毒RNA的影響。.然后作者使用CRISPR-Cas基因編輯敲除了ac4C轉(zhuǎn)移酶NAT10，在NAT10敲除細(xì)胞中可以明顯觀察到病 毒Gag結(jié)構(gòu)基因、病 毒RNA表達(dá)量下調(diào)，熒光素酶也具有相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，作者也利用NAT10的抑 制劑Remodelin在正常細(xì)胞中重復(fù)了這一過程，并且發(fā)現(xiàn)添加了抑 制劑能夠降低70%的HIV復(fù)制，而對(duì)NAT10細(xì)胞病 毒復(fù)制不起作用，因此NAT10可能是HIV的重要輔因子。

圖例5：依賴于NAT10的ac4C沉積在HIV-1 RNA的多個(gè)位置

為了進(jìn)一步研究依賴于NAT10的ac4C修飾在HIV感 染中的作用，作者進(jìn)行了NAT10的過表達(dá)/功能缺失實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAT10過表達(dá)細(xì)胞中HIV-1的轉(zhuǎn)錄本明顯高于其他組。為了研究NAT10是如何調(diào)節(jié)HIV復(fù)制的，作者進(jìn)行了一個(gè)單周期使用WT或nat10突變株進(jìn)行HIV-1復(fù)制實(shí)驗(yàn)并測(cè)量HIV-1復(fù)制周期中不同步驟的效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nat10突變株中表達(dá)減少約70%，表明NAT10的影響主要在RNA水平。此外通過脈沖追蹤、放線菌素D抑 制轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)NAT10/ac4C實(shí)際是通過影響HIV-1轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性，來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

圖例6：NAT10敲除影響對(duì)HIV-1轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性

(3)ac4C修飾對(duì)HIV的影響
之前的研究發(fā)現(xiàn)ac4C除了影響mRNA穩(wěn)定性，還可以提高翻譯效率從而提高細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)。為了確定是否只有CDS中存在的ac4C位點(diǎn)才會(huì)影響cis中的mRNA功能。作者將病 毒的env基因區(qū)域多個(gè)ac4C修飾保守位點(diǎn)中的C突變?yōu)閁，并轉(zhuǎn)染CD4陰性293T細(xì)胞，檢測(cè)了HIV-1中Gag蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)下調(diào)。說明突變了ac4C修飾位點(diǎn)會(huì)抑 制HIV-1中Gag蛋白的表達(dá)。

圖例7：ac4C位點(diǎn)的沉默突變降低了病 毒Gag的表達(dá)

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