circRNA在胃癌海綿調控機制的應用

文章導讀
環(huán)狀RNA (circRNA)作為新型非編碼RNA,具有比線性RNA更加穩(wěn)定的環(huán)狀結構，可通過多種機制調控靶基因。近年來，circRNA被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織和細胞中異常表達，作為腫瘤的診斷生物標志物或治療靶點，具有巨大的價值，受到廣泛的關注。癌癥新的證據(jù)表明，circRNAs在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調控作用。云序用戶山東大學劉志方課題組近期在Molecular Cancer雜志上發(fā)表的文章，通過全轉錄組測序、分子實驗和細胞動物表型實驗探討了hsa_circ_0004872在胃癌（GC）中的作用及其調控機制。

 

發(fā)表雜志：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時間：2020.11.10
技術方法：全轉錄組測序、RIP-qPCR、pull down、雙熒光素酶實驗、ChIP
文章鏈接：Circular RNA hsa_circ_0004872 inhibits gastric cancer progression via the miR-224/Smad4/ADAR1 successive regulatory circuit

1. 高通量測序篩選發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004872在GC中下調
作者通過對全轉錄組測序進行circRNA分析，篩選出4個在GC中差異表達的circRNA，通過在42對組織樣品中進行qPCR驗證篩選出差異最顯著的hsa_circ_0004872，并通過sanger測序驗證了反式剪切位點處序列。作者還進一步擴大樣品量，在34對組織樣品中qPCR驗證了hsa_circ_0004872的差異表達，并通過酶耐受實驗驗證了該環(huán)狀的穩(wěn)定性。

2. 細胞實驗驗證過表達hsa_circ_0004872抑制GC細胞增殖、侵襲和遷移
在GC細胞中通過構建的質粒過表達hsa_circ_0004872發(fā)現(xiàn)抑制了細胞的增殖、侵襲和遷移。而通過siRNA敲降hsa_circ_0004872則增加了細胞增侵襲和遷移。

3. hsa_circ_0004872作為分子海綿吸附miR-224
作者首先通過FISH實驗觀測到hsa_circ_0004872主要分布在細胞質。然后通過RIP-qPCR驗證到hsa_circ_0004872與AGO2蛋白結合，pull down實驗顯示hsa_circ_0004872與miR-224結合。qPCR顯示敲降和過表達hsa_circ_0004872可以影響miR-224轉錄本水平，并且在GC組中miR-224也檢測到差異表達。雙熒光素酶實驗也證實了miR-224可以與hsa_circ_0004872結合。

4. miR-224通過靶向p21和Smad4促進GC細胞增殖、侵襲和遷移
驗證了hsa_circ_0004872結合并調控miR-224后，作者接下來驗證了miR-224對細胞的影響。EdU和CCK-8實驗證實了miR-224促進GC細胞增殖。劃痕傷口愈合實驗和transwell實驗證實了miR-224促進GC細胞侵襲和遷移。對miR-224下游靶基因的研究發(fā)現(xiàn)，miR-224可抑制p21 和Smad4基因的轉錄本和蛋白水平。雙熒光素酶實驗進一步驗證到miR-224結合p21 和Smad4的3’-UTR區(qū)。最后，敲降hsa_circ_0004872后驗證到了p21 和Smad4的表達受到抑制。

5. 回補實驗證明hsa_circ_0004872通過 miR-224產生抑癌作用
作者在過表達hsa_circ_0004872的細胞中轉入miR-224，發(fā)現(xiàn)可終止hsa_circ_0004872對細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，同時也會使原本升高的Smad4和p21表達降低。

 

6. 體內實驗驗證hsa_circ_0004872抑制腫瘤發(fā)生和轉移
通過皮下注射過表達hsa_circ_0004872的BGC-823細胞和對照組BGC-823細胞發(fā)現(xiàn)，過表達hsa_circ_0004872組生成的腫瘤明顯小于對照組，并且腫瘤中Smad4和p21表達升高。尾靜脈注射實驗也發(fā)現(xiàn)過表達hsa_circ_0004872組肺表面形成的轉移性結節(jié)明顯要小于對照組。這些結果表明，hsa_circ_0004872能夠抑制腫瘤的發(fā)生和轉移。

 
7. hsa_circ_0004872受RNA編輯蛋白ADAR1調控
為了尋找調控hsa_circ_0004872的因素，作者通過對數(shù)據(jù)庫中GC樣品中基因表達情況進行分析發(fā)現(xiàn)RNA結合蛋白ADAR1在GC組中經常顯著上升，并通過qPCR進行了驗證。同時數(shù)據(jù)分析也顯示GC 組織中ADAR1蛋白的高表達與短生存周期相關。于是，作者在GC細胞中敲降和過表達ADAR1，發(fā)現(xiàn)敲降ADAR1后hsa_circ_0004872表達上升，miR-224表達水平降低；而過表達ADAR1，hsa_circ_0004872表達降低并且miR-224水平上升。這些結果表明ADAR1可以通過hsa_circ_0004872調控miR-224。

8. Smad4通過ADAR1調控hsa_circ_0004872
最后，有趣的是，hsa_circ_0004872通過miR-224調控的靶基因Smad4是一個轉錄因子，作者通過ChIP-PCR實驗和雙熒光素酶實驗驗證到了Smad4可以結合ADAR1的啟動子區(qū)，并且在GC細胞過表達Smad4會降低ADAR1的mRNA和蛋白水平。對數(shù)據(jù)庫中GC組織樣品的生信分析顯示ADAR1的表達與Smad4的表達負相關，并且Smad4的低表達與短生存周期相關。

 

 

總結
本研究通過全轉錄組測序篩選出在GC組織中下調的hsa_circ_0004872，通過RIP-qPCR、pull down、和雙熒光素酶實驗驗證了其通過海綿機制吸附miR-224從而調控下游靶基因p21 和Smad4，產生抑癌作用。并且通過ChIP實驗和雙熒光素酶實驗驗證了轉錄因子Smad4又通過調控RNA結合蛋白ADAR1調控hsa_circ_0004872形成一個反饋回路。

云序生物環(huán)狀RNA研究優(yōu)勢
云序生物作為國內早期提供環(huán)狀RNA測序的測序公司，自行建立的環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫circDB，憑借物種覆蓋廣、數(shù)據(jù)量大、疾病背景多的特點為客戶提供優(yōu)質的服務。云序積累了超過10000例環(huán)狀RNA測序的經驗，樣本覆蓋20多個物種以及50多種疾病。云序生物提供系統(tǒng)性環(huán)狀RNA服務，從篩選（circRNA測序）到驗證（qPCR）再到機制研究（RIP、RNA pull-down、ChIP）以及上游表觀調控（m6A甲基化等各類RNA修飾研究），全方位的覆蓋環(huán)狀RNA上下游分子機制驗證的重要研究環(huán)節(jié)。除了提供組織和細胞的樣本類型測序之外，我們還提供體液、血清血漿、外泌體石蠟樣本等特殊樣本的測序服務。
 
云序環(huán)狀RNA課題技術服務四大模塊
一、 環(huán)狀RNA篩選：
1.1 circRNA測序
1.2 全轉錄組測序
同時檢測circRNA、lncRNA、mRNA
二、環(huán)狀RNA驗證
2.1 qRT-PCR
對選定目標RNA分子可進行qPCR檢測服務，包括引物設計與表達鑒定。
2.2 Sanger測序與RNase R酶耐受實驗
對選定的環(huán)狀RNA分子進行反式剪切位點引物設計，擴增后Sanger測序驗證環(huán)狀；使用RNase R酶處理環(huán)狀RNA分子，驗證環(huán)狀RNA分子穩(wěn)定性。
三、 CircRNA功能機制研究
3.1 RIP測序/RIP-qPCR
針對目標蛋白抗體把蛋白-RNA復合物沉淀下來，并對復合物上的RNA進行測序或對目標RNA進行qRCR表達分析。
3.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
設計目標RNA生物探針把相應的結合蛋白質與RNA復合物沉淀下來，蛋白質譜檢測或WB檢測與RNA結合的蛋白。設計目標RNA生物探針把相應的結合蛋白質與RNA復合物沉淀下來，qPCR檢測或RNA-seq檢測與RNA結合的RNA。
3.3 雙熒光素酶報告實驗
雙熒光素酶報告實驗檢測兩個基因之間的互作。
3.4 ChIP測序/ChIP-PCR
檢測轉錄因子或者組蛋白與下游基因的結合情況。
四、CircRNA修飾研究
4.1 m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修飾
針對環(huán)狀RNA各類修飾進行高通量篩選。
4.2 MeRIP-circRNA-PCR驗證
對高通量測序的結果，通過qPCR進行進一步驗證。
 
 

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