RNA以m6A依賴方式調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)和基因轉(zhuǎn)錄的應(yīng)用

文章導(dǎo)讀
N6-甲基腺苷(m6A)在多種生物過程中能夠調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。但m6A修飾是否會對DNA轉(zhuǎn)錄或染色體開放性產(chǎn)生影響并未可知。于2020年1月16日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“N6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription”，打破了遺傳指令從DNA到RNA再到蛋白的單向流動固有看法，為基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供了新的思路。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)敲除小鼠胚胎干細(xì)胞中m6A甲基化相關(guān)酶Mettl3或Ythdc1以m6A依賴的方式通過染色體相關(guān)調(diào)控RNA（chromosome-associated regulatory RNA， carRNA），增加染色質(zhì)開放性，并激活轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)對我們理解人類疾病和藥物設(shè)計(jì)具有重要意義。
  發(fā)表期刊：Science
影響因子：41.845
文章鏈接：N6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription


研究內(nèi)容
（1）m6A修飾對核內(nèi)染色質(zhì)的開放性及基因轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用
作者研究了兩個獨(dú)立的Mettl3 KO mESCs株系(Mettl3−/−−1和Mettl3−/−−2)并分析新轉(zhuǎn)錄的RNA水平。相比于野生型WT mESCs，Mettl3 KO mESCs在的新生轉(zhuǎn)錄本明顯增加(圖1A)。作者構(gòu)建了WT Mettl3或突變體Mettl3的穩(wěn)定細(xì)胞系(圖S1A)。Mettl3 KO上新生轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄增加這與WT中相反(圖1B)。那么，Mettl3缺失是否會影響染色質(zhì)的整體狀態(tài)。通過脫氧核糖核酸酶(DNase I)介導(dǎo)的TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Mettl3 KO mESCs的染色質(zhì)開放性明顯增加。此外，Mettl3 WT株系中逆轉(zhuǎn)了染色質(zhì)開放性的增加，表明染色質(zhì)的開放性與m6A修飾相關(guān)(圖1，C和D)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明RNA m6A對核內(nèi)染色質(zhì)的開放性及基因轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。
 
（2）Mettl3和Ythdc1 均會影響CarRNA的表達(dá)穩(wěn)定性
通過LC-MS/MS（云序可提供）發(fā)現(xiàn)Mettl3 KO中非核糖體染色體相關(guān)RNA (caRNAs)的m6A/A比值明顯下降（圖2A），表明m6A對caRNAs有作用。接下來對Mettl3 KO和WT mESCs中的caRNAs進(jìn)行m6A-MeRIP-seq（云序可提供），Mettl3 KO后m6A水平整體下降(圖2A)。分析了三種具有潛在調(diào)控功能的caRNAs：啟動子相關(guān)RNA (paRNA)，增強(qiáng)子RNA (eRNA)， 轉(zhuǎn)錄自可轉(zhuǎn)座元件RNA(重復(fù)RNA)。Mettl3 KO mESCs中這些carRNA的m6A水平明顯降低(圖2B)。將carRNAs分為 m6A修飾組和non-m6A修飾組，發(fā)現(xiàn)Mettl3 KO中m6A修飾組的轉(zhuǎn)錄豐度上調(diào)(圖2 C)。上述結(jié)果表明，m6A甲基化使這些carRNA表達(dá)不穩(wěn)定。
先前研究發(fā)現(xiàn)，Ythdc1與負(fù)責(zé)某些非編碼核RNA降解的復(fù)合物NEXT相關(guān)，作者假設(shè)Ythdc1識別m6A標(biāo)記的carRNA，并在mESCs中觸發(fā)其NEXT衰變。研究發(fā)現(xiàn)，在Ythdc1 CKO mESCs中發(fā)現(xiàn)了更多的基因間的高甲基化峰。這表明Ythdc1與Mettl3類似，主要影響基因間轉(zhuǎn)錄的caRNAs。檢測了Ythdc1敲除的carRNAs，發(fā)現(xiàn)重復(fù)RNA的m6明顯增加，表明Ythdc1在mESCs中影響重復(fù)RNA的穩(wěn)定性。此外分析發(fā)現(xiàn)Mettl3 KO與Ythdc1 KO之間存在明顯的負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步表明Ythdc1促進(jìn)了這些carRNA的部分衰減。核RNA衰變分析發(fā)現(xiàn)三組carRNA在Ythdc1 CKO上的半衰期明顯增加（圖2D），在Ythdc1 CKO后carRNA中m6A修飾組RNA的半衰期比非m6A修飾組RNA的半衰期更長（圖2E）。

（3）carRNA m6A甲基化修飾下調(diào)促進(jìn)染色質(zhì)開放與基因轉(zhuǎn)錄
LINE1是一類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，在重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄中起重要作用。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)L1Md_F（LINE1家族成員）以依賴于m6A的方式受Ythdc1和Mettl3調(diào)控。Mettl3 KO增加轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)開放性(圖1)，這些變化是否受到carRNA甲基化的調(diào)控？作者對新生轉(zhuǎn)錄物和全核RNA進(jìn)行了RNA-seq（云序可提供）和mNET-seq。在Mettl3 KO上轉(zhuǎn)錄本整體水平(圖3A和B)和轉(zhuǎn)錄速率(圖3C和D)增加。在Mettl3 KO mESCs中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因往往比下調(diào)的基因在carRNA上游具有更多的m6A標(biāo)記(圖3，A和B)。而且，carRNA中上游發(fā)生m6A修飾的基因比非m6A修飾的基因轉(zhuǎn)錄速率更高。表明Mettl3 KO中carRNA m6A甲基化修飾下降，激活了下游基因的轉(zhuǎn)錄。Mettl3 KO中所有m6A依賴基因carRNA上游甲基化減少(~6584個基因)，它們的轉(zhuǎn)錄速率都提高了(圖3 G)，這些基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)修飾和干細(xì)胞群體維持。因此，carRNA m6A甲基化修飾下調(diào)不但促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄，還可能激活與染色質(zhì)開放相關(guān)的基因表達(dá)。
super-enhancers與其靶基因的互作受到mESCs中外泌體調(diào)控轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄的影響。檢測發(fā)現(xiàn)約80%的 super-enhancers RNA (seRNAs)含有m6A峰(圖3H)。Mettl3 KO上seRNAs的m6A甲基化水平降低，m6A修飾的seRNAs與非m6A修飾的seRNAs相比，轉(zhuǎn)錄豐度更高(圖3I)。Mettl3 KO中m6A水平降低的seRNAs與下游基因轉(zhuǎn)錄率升高相關(guān)(圖3J)；轉(zhuǎn)錄速率差異大于1的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)修飾和干細(xì)胞維護(hù)，與其他carRNAs的結(jié)果一致。
 
（4）m6A調(diào)控的carRNA穩(wěn)定染色質(zhì)的開放狀態(tài)，并招募TFs促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活
那么carRNA甲基化改變?nèi)绾斡绊懭旧�質(zhì)狀態(tài)變化？作者進(jìn)行了ChIP-seq，觀察到在Mettl3 KO上與H3K4me3和H3K27ac結(jié)合水平整體升高。此外，在Mettl3 KO mESCs中，上游發(fā)生m6A修飾的carRNA與H3K4me3和H3K27ac結(jié)合水平較無m6A修飾的carRNA更高(圖4A)。這些數(shù)據(jù)表明，Mettl3 KO mESCs中carRNA上游的穩(wěn)定可增加活性組蛋白標(biāo)記的沉積。作者認(rèn)為carRNAs可以招募蛋白（CBP/EP300和YY1）從而促進(jìn)染色質(zhì)開放和激活轉(zhuǎn)錄。ChIP-seq（云序可提供）顯示EP300和YY1與Mettl3 KO mESCs結(jié)合(圖4，B和C)，與鄰近eRNAs或paRNAs的高豐度相關(guān)。此外，EP300和YY1的結(jié)合均與附近的carRNA的m6A水平呈負(fù)相關(guān)(圖4，D和E)，Mettl3 KO導(dǎo)致EP300和YY1在m6A缺失區(qū)域的結(jié)合升高(圖4，F(xiàn)和G）。在Mettl3 KO中同時帶有m6A修飾的carRNA和與EP300或YY1結(jié)合的基因組區(qū)域與帶有m6A或與EP300或YY1結(jié)合的基因組區(qū)域，H3K27ac的增加幅度zui大(圖4H)。對JARID2（PRC2的一個成分）進(jìn)行了ChIP-seq，因?yàn)镽NA轉(zhuǎn)錄本可以阻止PRC2的結(jié)合，以保持染色質(zhì)的開放。因此，這些m6A調(diào)控的carRNA可以穩(wěn)定染色質(zhì)的開放狀態(tài)，不但通過招募活躍的TFs，還可以在甲基化缺失時排斥抑制因子，如PRC2。

（5）carRNA的m6A甲基化保持carRNA的穩(wěn)定性和下游基因的轉(zhuǎn)錄
LINE1 的升高也可能調(diào)節(jié)染色質(zhì)的整體開放性。作者阻斷了Mettl3−/−mESCs中LINE1 RNA的表達(dá)，觀察到染色質(zhì)開放性總體降低(圖4I)。當(dāng)使用dCas13b-wt FTO gRNA靶向LINE1時，觀察到LINE1的m6A水平下降，半衰期增加，染色質(zhì)開放性增加。然后，將dCas13b-FTO應(yīng)用于上游含有m6A標(biāo)記的carRNA的基因。當(dāng)使用gRNAs和dCas13b-wt FTO靶向carRNAs時，觀察到位點(diǎn)特異性甲基化減少，而使用dCas13b-mu FTO或陰性對照則甲基化變化很小(圖4J)。此外這些carRNAs的半衰期增加，下游基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，局部H3K4me3和H3K27ac水平升高(圖4J)。上述結(jié)果表明carRNA的m6A甲基化保持carRNA的穩(wěn)定性和下游基因的轉(zhuǎn)錄。
總結(jié)
在本研究中結(jié)合 LC-MS/MS、m6A-meRIP-seq、RNA-seq、ChIP-seq等多項(xiàng)分子手段發(fā)現(xiàn)carRNA可以被Mettl3修飾并對后續(xù)轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。這些m6A修飾的carRNAs(主要是LINE1重復(fù)序列)會被Ythdc1通過NEXT復(fù)合物破壞其穩(wěn)定性。其中m6A作為一個開關(guān)，能夠影響carRNAs的豐度，從而調(diào)節(jié)附近的染色質(zhì)狀態(tài)和下游轉(zhuǎn)錄。m6A甲基化對carRNA的影響不同；m6A在不同細(xì)胞中可以穩(wěn)定修飾carRNAs。在mESCs中，m6A缺失誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活伴隨著染色質(zhì)開放性的增加、某些TFs的富集和組蛋白標(biāo)記的升高，揭示了在carRNA m6A甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)之間具有直接相關(guān)性。研究結(jié)果表明，carRNA 的m6A修飾對轉(zhuǎn)錄具有額外的調(diào)控作用。


云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉(zhuǎn)錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測序
• m6A  miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精zhun高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。

云序生物服務(wù)優(yōu)勢
優(yōu)勢一：發(fā)表10分以上文章多的m6A RNA甲基化測序服務(wù)平臺。云序已累計(jì)支持客戶發(fā)表42篇高水平文章，合計(jì)影響因子300分+，是國內(nèi)支持發(fā)文多、累計(jì)影響因子高的公司。
優(yōu)勢二：至今完成4000+例 m6A測序樣本，覆蓋醫(yī)口、農(nóng)口等各類樣本。
優(yōu)勢三：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢四：提供m6A一站式服務(wù)：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗(yàn)證、RIP和RNA pull-down。
優(yōu)勢五：率先研發(fā)超微量MeRIP測序技術(shù)，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢六：國內(nèi)全zui的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙�；�和2'-O-甲基化測序。