FBW7靶向m6A結(jié)合蛋白YTHDF2在抑制卵巢癌的應(yīng)用

文章導(dǎo)讀
隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制逐漸被揭示。其中腫瘤抑制因子FBW7是能介導(dǎo)致癌基因蛋白降解的SCF E3泛素連接酶復(fù)合物的潛在識(shí)別成分。然而FBW7在腫瘤中發(fā)揮怎樣的作用仍未被闡明。2021年3月3日，云序客戶復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院吳小華教授課題組在Molecular Cancer 上在線發(fā)表題為“FBW7 suppresses ovarian cancer development by targeting the N6-methyladenosine binding protein YTHDF2”的研究論文，該研究運(yùn)用云序生物m6A- meRIP-seq和RNA-seq等方法發(fā)現(xiàn)FBW7能夠通過YTHDF2介導(dǎo)的BMF mRNA降解抑制卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。該結(jié)果具有重要的臨床意義，為抗癌療法的未來(lái)發(fā)展提供了重要的理論基礎(chǔ)。
  發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
研究方法：m6A- meRIP-seq、RNA-seq
文章鏈接：FBW7 suppresses ovarian cancer development by targeting the N 6-methyladenosine binding protein YTHDF2


研究?jī)?nèi)容
（1）人類卵巢癌中FBW7下調(diào)與不良預(yù)后和m6A修飾水平下調(diào)相關(guān)。
作者比較了FBW7在癌變和非癌變卵巢組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)FBW7在卵巢癌組織中下調(diào)(圖1a、b)。通過免疫組化(IHC)染色，分析FBW7在包含120個(gè)腫瘤樣本的卵巢癌組織芯片中的表達(dá)情況，將卵巢癌樣本分為兩類FBW7低、高表達(dá)組(圖1c、d)。然后作者探討了FBW7表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示，高水平的FBW7與良好的卵巢癌總生存期相關(guān)(圖1e, P = 0.04)。此外，高水平的FBW7與更好的無(wú)進(jìn)展生存(PFS)呈正相關(guān)，但不明顯(圖1f)。因此，這些觀察結(jié)果表明FBW7是一種可能抑制卵巢腫瘤發(fā)生和發(fā)展的良好預(yù)后標(biāo)志物。為了研究m6A修飾是否影響FBW7的調(diào)控，作者測(cè)定了60個(gè)人卵巢癌組織樣本中的m6A水平。發(fā)現(xiàn)在FBW7表達(dá)水平較高的腫瘤患者中，m6A水平升高(圖1g)，且較好的總生存率與較高的m6A水平相關(guān)(圖1h)，表明FBW7可能受m6A調(diào)控。
 

（2）FBW7作為腫瘤抑制因子抑制卵巢癌細(xì)胞增殖
為了研究FBW7在卵巢癌中的生物學(xué)功能，作者在SKOV3和OVCAR429細(xì)胞系中創(chuàng)建了FBW7穩(wěn)定過表達(dá)系維持內(nèi)源性FBW7低表達(dá)水平(圖2a)。過表達(dá)FBW7抑制卵巢癌細(xì)胞增殖(圖2b)、集落形成(圖2c)和細(xì)胞生長(zhǎng)(圖2d)能力。腫瘤抑制活性可能歸因于誘導(dǎo)凋亡，因?yàn)楫惓１磉_(dá)的FBW7增加了Annexin Vpositive細(xì)胞數(shù)量(圖2e)。此外，作者建立了一種異種移植小鼠模型來(lái)檢測(cè)FBW7是否在體內(nèi)抑制了卵巢腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組異位FBW7抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)(圖2f)，其腫瘤體積和重量均有抑制(圖2g和h)。此外，敲除FBW7促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、集落形成和細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。這些結(jié)果說(shuō)明FBW7在卵巢癌中具有抑瘤作用。
 

 

（3）FBW7誘導(dǎo)YTHDF2泛素化和蛋白酶體降解。

為了闡明FBW7介導(dǎo)的m6A修飾系統(tǒng)的分子機(jī)制，作者進(jìn)行了FBW7抗體的Co-IP實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析證實(shí)了FBW7與SKOV3癌細(xì)胞中的YTHDF2結(jié)合(圖3a)。免疫熒光(IF)染色提示相互作用可能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中(圖3b)。FBW7是否通過相互作用調(diào)節(jié)YTHDF2蛋白的穩(wěn)定性。過表達(dá)FBW7后YTHDF2蛋白水平明顯下降，而通過蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后，這種下降完全恢復(fù)(圖3c)。此外，由環(huán)己酰亞胺追逐實(shí)驗(yàn)可知FBW7過表達(dá)縮短了YTHDF2的半衰期(圖3d)。此外也發(fā)現(xiàn)FBW7提高了YTHDF2的泛素化(圖3e)，這在另一組使用抗YTHDF2抗體的泛素化實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)(圖3f)。上述結(jié)果說(shuō)明在卵巢癌中，F(xiàn)BW7促進(jìn)YTHDF2泛素化介導(dǎo)的蛋白降解來(lái)調(diào)節(jié)m6A修飾系統(tǒng)。
 
（4）YTHDF2與卵巢癌FBW7表達(dá)及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)
由于YTHDF2是腫瘤抑制因子FBW7降解的底物，那么是否這兩種蛋白之間的負(fù)相關(guān)也存在于原發(fā)性卵巢癌組織中？首先，作者發(fā)現(xiàn)YTHDF2在卵巢癌中表達(dá)升高(圖4a)。此外YTHDF2的表達(dá)與FBW7之間存在負(fù)相關(guān)(圖4b和c)。根據(jù)YTHDF2的表達(dá)水平將腫瘤標(biāo)本分為兩組(圖4d)，分析各組的臨床病理特征。Kaplan-Meier生存分析顯示YTHDF2表達(dá)增加與卵巢癌較差的總生存期(OS)相關(guān)(圖4e）。然而，YTHDF2并不是無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)的一個(gè)合適的預(yù)后指標(biāo)（圖4 f)。FBW7高表達(dá)/YTHDF2低表達(dá)組OS優(yōu)于FBW7低表達(dá)/YTHDF2高表達(dá)組。在多變量分析中，YTHDF2的表達(dá)是OS的不利的獨(dú)立預(yù)后因子。這些結(jié)果標(biāo)明YTHDF2可能促進(jìn)卵巢癌的生存和生長(zhǎng)。
（5）YTHDF2在卵巢癌中是一種致癌蛋白
為了驗(yàn)證這個(gè)YTHDF2參與卵巢癌的發(fā)展，作者在SKOV3和OVCAR420細(xì)胞系中創(chuàng)制了兩種獨(dú)立的ythdf2缺失株系(圖5a)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ythdf2缺失抑制了細(xì)胞增殖(圖5b)、集落形成(圖5b)和細(xì)胞生長(zhǎng)能力(圖5d)。此外，流式細(xì)胞儀分析顯示，ythdf2缺失可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡(圖5e)。此外，異種移植小鼠模型顯示ythdf2缺失抑制了體內(nèi)卵巢腫瘤的生長(zhǎng)(圖5f)，導(dǎo)致腫瘤體積和重量減少(圖5g和h)。并且敲除YTHDF2恢復(fù)了由FBW7降解誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和集落形成能力(圖5i-k)。上述結(jié)果說(shuō)明YTHDF2可能驅(qū)動(dòng)卵巢癌的發(fā)展，而FBW7通過誘導(dǎo)蛋白降解抑制卵巢癌的發(fā)生，從而降低其致癌活性。

（6）BMF是FBW7-YTHDF2的級(jí)聯(lián)效應(yīng)因子
YTHDF2被證明會(huì)促使m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的衰變，那么FBW7是否通過抑制YTHDF2調(diào)節(jié)細(xì)胞m6A富集？采用LC-MS/MS法定量m6A水平，發(fā)現(xiàn)YTHDF2的敲除增加了卵巢癌細(xì)胞系(圖6a)中m6A豐度。FBW7過表達(dá)導(dǎo)致m6A升高(圖6b)。作者還確定了FBW7介導(dǎo)調(diào)控m6A豐度依賴于YTHDF2，YTHDF2的敲除中和了FBW7敲除對(duì)m6A水平的影響(圖6c)。通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)敲除YTHDF2導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞中348個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，320個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖6d)。m6A- meRIP-seq檢測(cè)了ythdf2敲除細(xì)胞系和正常細(xì)胞系結(jié)果表明，m6A峰主要位于CDS區(qū)(42.3%)(圖6 e)。m6A motif序列為GGAC [U/A](圖6f)，表明YTHDF2也可能在卵巢癌中與m6A結(jié)合。通過結(jié)合RNA-seq和m6A- meRIP-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)YTHDF2敲除后有25個(gè)基因中有39個(gè)峰持續(xù)升高(圖6g)。在這些異常調(diào)節(jié)的基因中，BMF是編碼一個(gè)促凋亡的BH3-only Bcl2家族蛋白，與對(duì)照組相比，BMF在YTHDF2敲除后表現(xiàn)出更高的峰富集(圖6 h)。進(jìn)一步證實(shí)YTHDF2的敲除提高了BMF mRNA的表達(dá)水平并延長(zhǎng)了其半衰期(圖6j)，說(shuō)明BMF mRNA是YTHDF2降解的靶點(diǎn)。由于m6A修飾是YTHDF2誘導(dǎo)的mRNA衰減必不可少的，那么是否m6A降低BMF mRNA的穩(wěn)定性？如圖6k所示，用甲基化抑制劑處理SKOV3細(xì)胞后，BMF mRNA水平升高，表明甲基化對(duì)BMF mRNA的降解至關(guān)重要(圖6k)。
RIP檢測(cè)證明了YTHDF2與BMF的互作(圖6l)。YTHDF2過表達(dá)降低了BMF的表達(dá)。YTHDF2對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響可以通過恢復(fù)BMF表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)。此外，F(xiàn)BW7的過表達(dá)與YTHDF2的下調(diào)一樣，誘導(dǎo)了BMF mRNA水平(圖6m)，這是由于FBW7降解YTHDF2(圖3c-f)。此外，F(xiàn)BW7的過表達(dá)或敲除YTHDF2增加了m6A修飾的水平(圖6n)。FBW7介導(dǎo)的BMF調(diào)控依賴于YTHDF2(圖6o)。與這些體外結(jié)果一致，作者也揭示了在卵巢癌組織中BMF的表達(dá)與YTHDF2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6p)，而與FBW7表達(dá)呈正相關(guān)(圖6q)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)BW7通過在卵巢癌中的閱讀蛋白YTHDF2調(diào)節(jié)m6A的一種依賴機(jī)制刺激促凋亡BMF的表達(dá)(圖6r)。
總結(jié)
這篇文章結(jié)合 LC-MS/MS、m6A-meRIP-seq、RNA-seq、RIP等實(shí)驗(yàn)手段探究了FBW7通過調(diào)節(jié)在卵巢癌中的閱讀蛋白YTHDF2來(lái)調(diào)控m6A修飾水平進(jìn)而刺激促凋亡基因BMF的表達(dá)。該研究表明YTHDF2是潛在的癌癥治療靶標(biāo)，為靶向治療癌癥提供了新的思路。


云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測(cè)序
m6A RNA修飾測(cè)序（m6A-meRIP-seq）
對(duì)m6A RNA甲基化，目前流行的檢測(cè)手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測(cè)序：

• m6A 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測(cè)序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測(cè)序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測(cè)序
• m6A  miRNA測(cè)序

02 檢測(cè)整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類修飾水平檢測(cè)，一步到位。
比色法
快速檢測(cè)m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。