微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法的研究進展！

微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法的研究進展！


微生物初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的生物合成與培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件密切相關(guān)，而在一個高度非線性、非結(jié)構(gòu)化的復(fù)雜系統(tǒng)中要獲得最佳工藝，試驗優(yōu)化技術(shù)具有很重要的作用。本文綜述了單因子試驗、正交試驗、均勻設(shè)計、響應(yīng)面設(shè)計、遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等優(yōu)化技術(shù)并進行了展望。

微生物發(fā)酵是指微生物利用一些原料養(yǎng)分在合適的發(fā)酵條件下經(jīng)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)變成所需產(chǎn)物的一類復(fù)雜的生物過程，涉及到許多相互影響的因素，產(chǎn)物生物合成水平除受微生物內(nèi)部代謝機理、調(diào)控機制等影響外，還有外界環(huán)境(培養(yǎng)基組成與配比、發(fā)酵溫度 、發(fā)酵pH、溶氧等)的影響 。因此，最大限度地合成目的產(chǎn)物并非易事，并且對于一個高度非線性、非結(jié)構(gòu)化的復(fù)雜發(fā)酵系統(tǒng)而言，要建立一個準確、滿意的合成模型則更為困難，而試驗優(yōu)化技術(shù)的應(yīng)用，特別是多元方程擬合技術(shù)(響應(yīng)技術(shù))的應(yīng)用可以很好地解決該問題。傳統(tǒng)的優(yōu)化技術(shù)(如單因素法)雖然方法簡單、易行，結(jié)果較直觀，但在考察多個因素時會浪費大量時間，且有可能導致不可靠的甚至錯誤的結(jié)論，因此，常常僅作為過程優(yōu)化的初步試驗。在考察多個因素時，為了減少試驗次數(shù)，節(jié)省時間，通常采用統(tǒng)計優(yōu)化技術(shù)，這是因為統(tǒng)計優(yōu)化技術(shù)無論從試驗設(shè)計到數(shù)據(jù)分析以及模型的建立與統(tǒng)計學密切相關(guān)，它能夠以較少的試驗次數(shù)獲得極為豐富的統(tǒng)計信息。因此，被廣泛地應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化中，以確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，從而實現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低消耗等經(jīng)濟目標，本文對常用的優(yōu)化試驗方法進行了綜述。

一、單因素試驗法

單因素試驗是在假設(shè)因素間不存在交互作用的前提下，通過一次只改變一個因素且保證其他因素維持在恒定水平的條件下，研究不同試驗水平對結(jié)果的影響，然后逐個因素進行考察的優(yōu)化方法，是試驗研究中最常用的優(yōu)化策略之一。王曉輝等人利用單因素試驗對BS070623蛋白酶高產(chǎn)突變株進行了發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗，取得了良好效果。然而，對于大多數(shù)培養(yǎng)基而言，其組分相當復(fù)雜，僅通過單因素試驗往往無法達到預(yù)期的效果，特別是在試驗因素很多的情況下 ，需要進行較多的試驗次數(shù)和試驗周期才能完成各因素的逐個優(yōu)化篩選，因此，單因素試驗經(jīng)常被用在正交試驗之前或與均勻設(shè)計、響應(yīng)面分析等結(jié)合使用。利用單因子試驗和正交試驗相結(jié)合的方法，可用較少的試驗找出各因素之間的相互關(guān)系，從而較快地確定出培養(yǎng)基的最佳組合。較常見的是先通過單因素試驗確定最佳碳、氮源，再進行正交試驗，或者通過單因素試驗直接確定最佳碳氮比，再進行正交試驗。

二、正交設(shè)計試驗法

正交設(shè)計試驗法是利用一套表格，設(shè)計多因素、多指標、多因素間存在交互作用而具有隨機誤差的試驗，并利用普通的統(tǒng)計分析方法來分析試驗結(jié)果。正交設(shè)計試驗法對因素的個數(shù)沒有嚴格的限制，而且無論因素之間有無交互作用，均可使用。利用正交表可于多種水平組合中，挑出具有代表性的試驗點進行試驗，它不僅能以全面試驗大大減少試驗次數(shù)，而且能通過試驗分析把好的試驗點(即使不包含在正交表中的)找出來。利用正交設(shè)計試驗得 出的結(jié)果可能與傳統(tǒng)的單因素試驗法的結(jié)果一致，但正交試驗設(shè)計考察因素及水平合理、分布均勻，不需進行重復(fù)試驗，誤差便可估計出來，因而計算精度較高，特別是在試驗因素越多 、水平越多、因素之間交互作用越多時，優(yōu)勢表現(xiàn)越明顯，此時，使用單因素試驗法幾乎不可能實現(xiàn)。孟和畢力格等人利用正交試驗對傳統(tǒng)乳制品中產(chǎn)γ-GABA乳酸菌培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，獲得了滿意結(jié)果，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基于32℃發(fā)酵培養(yǎng) 96 h，產(chǎn)物含量高達10.78 g／L。鐘為章等人采用L16正交表對紅螺菌科光合細菌液體培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，利用優(yōu)化培養(yǎng)基在光照3000 lx、(32±2)℃條件下培養(yǎng)3d，細菌總數(shù)由1.63×109cfu／mL增殖至3.68x10 cfu／mL。蔡成崗等人以角蛋白酶為考察指標，采用正交試驗對枯草芽孢桿菌菌株KD—N2生產(chǎn)角蛋白酶培養(yǎng)基進行了優(yōu)化研究，產(chǎn)物酶活力可達到(66.5±2.04)U／mL。在正交試驗中，如果所考察的指標涉及到模糊 因子時，不能直接使用正交設(shè)計試驗法，可以把正交試驗結(jié)果模糊化，然后用模糊數(shù)學的理論和方法處理試驗數(shù)據(jù)。陳敏等人利用模糊正交法，把試驗結(jié)果模糊化，以模糊綜合評價值為目標函數(shù)優(yōu)化了鋅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基組成。模糊正交法通過把正交試驗結(jié)果模糊化，然后用模糊數(shù)學的理論和方法處理試驗數(shù)據(jù)，不僅能估計因素的主效應(yīng)，還可以估計因素的最佳搭配，能在同樣試驗工作量情況下獲得更多的信息。

三、均勻設(shè)計法

均勻設(shè)計法(Uniform Design)是一種考慮試驗點在試驗范圍內(nèi)充分均勻散布的試驗設(shè)計方法，其基本思路是盡量使試驗點充分均勻分散，使每個試驗點具有更好的代表性，但同時舍棄整齊可比的要求，以減少試驗次數(shù)，然后通過多元統(tǒng)計方法來彌補這一缺陷，使試驗結(jié)論同樣可靠，均勻設(shè)計一般采用二次型回歸模型：由于每個因素每一水平只作一次試驗，因此，當試驗條件不易控制時，不宜使用均勻設(shè)計法。對波動相對較大的微生物培養(yǎng)試驗 ，每一試驗組最好重復(fù) 2～3次以確定試驗條件是否易于控制，此外，適當?shù)卦黾釉囼灤螖?shù)可提高回歸方程的顯著性。均勻設(shè)計法與正交設(shè)計試驗法相比，試驗次數(shù)大為減少，因素、水平容量較大，利于擴大考察范圍，如當因素數(shù)為5，各因素水平為3l的試驗中，如果采取正交設(shè)計來安排試驗，則至少要做312=961次試驗 ，而用均勻設(shè)計只需要做31次試驗。在試驗數(shù)相同的條件下，均勻設(shè)計法的偏差比正交設(shè)計試驗法小。在使用均勻設(shè)計法進行條件優(yōu)化時，應(yīng)注意幾個問題：①正確使用均勻設(shè)計表，可參考方開泰制定的常用均勻設(shè)計表，每個均勻設(shè)計表都應(yīng)有一個試驗安排使用表，要注意變量、范圍和水平數(shù)的合理選擇。②不要片面追求過少的試驗次數(shù)，試驗次數(shù)最好是因素的3倍。③要重視回歸分析，為了避免回歸時片面追求回歸模型的項數(shù)、片面追求大的R2值和誤差自由度過小等問題，可通過選擇n稍大的均勻設(shè)計表，誤差自由度≥5，回歸模型最好不大于l0，在已知實際背景時少用多項式，在采用多項式回歸時盡量考慮二次的。④善于利用統(tǒng)計圖表，在均勻設(shè)計中，各種統(tǒng)計點圖，如殘差圖、等高線圖、正態(tài)點圖、偏回歸圖等，對數(shù)據(jù)特性判定和建模滿意度的判斷非常有用。⑤均勻設(shè)計包的使用，如 DPS、SPSS、Sigmaplot、SAS等。王劍鋒等人利用均勻設(shè)計、二次多項式逐步回歸分析對煙管菌 Bjerkandera adusta WZFF．W—Y11產(chǎn)漆酶液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，在優(yōu)化條件下進行液態(tài)培養(yǎng)可穩(wěn)定獲得 9672U／L的漆酶活力。

四、響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學統(tǒng)計方法，是數(shù)學方法和統(tǒng)計方法結(jié)合的產(chǎn)物，它可以用來對人們受多個變量影響的響應(yīng)問題進行數(shù)學建模與統(tǒng)計分析 ，并可以將該響應(yīng)進行優(yōu)化。它能擬合因素與響應(yīng)間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，縮短優(yōu)化時間和提高應(yīng)用可信度。一般可以通過 Plackett—Burman (PB)設(shè)計法或 Central composite design (CCD)等從眾多因素中精確估計有主效應(yīng)的因素，節(jié)省實驗工作量。響應(yīng)面分析法以回歸法作為函數(shù)估算的工具，將多因子試驗中因子與試驗結(jié)果的相互關(guān)系，用多項式近似，把因子與試驗結(jié)果(響應(yīng)值)的關(guān)系函數(shù)化，依此可對函數(shù)的面進行分析，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進行優(yōu)化。周海鷗等人應(yīng)用 PB設(shè)計法對影響桑黃發(fā)酵的培養(yǎng)基組成進行篩選，再采用 CCD設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面對影響菌絲得率的關(guān)鍵因素最佳水平進行了深人研究，并通過二次方程回歸求解得到最優(yōu)化條件，此模型與預(yù)測值極為接近，吻合性較好。姜麗艷等人應(yīng)用PB設(shè)計法對影響乳鏈菌肽液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行了篩選，然后采用最陡爬坡實驗逼近 3個關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域 ，找到了最優(yōu)化的水平，在此培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液中乳鏈菌肽效價為 6033 U／mL，是優(yōu)化前的4．48倍。鐘國華¨蜘等人采用中心組分旋轉(zhuǎn)設(shè)計技術(shù)，根據(jù)菌絲干重和高效氯氰菊酯降解率，按照統(tǒng)計學要求檢測模型顯著性，分析了配方組合對降解菌生長量、高效氯氰菊酯降解率的影響和效應(yīng)，采用二次多項式逐步回歸分析模型，根據(jù)響應(yīng)面模型和預(yù)測回規(guī)模型方差分析對模型進行評價，以確定最佳培養(yǎng)基配方。利用優(yōu)化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌體干重為 450.30 mg／50 mL培養(yǎng)菌液，處理24 h對50 mg/L 高效氯氰菊酯降解率高達93.78％。王普等人用部分因子試驗篩選了影響 Candida tropicaJis 104產(chǎn)高選擇性羰基還原酶的因素，繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域并結(jié)合CCD和RSM對3個顯著性因素進行分析，得到了優(yōu)化的培養(yǎng)基組成，采用該優(yōu)化培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，供試菌株羰基還原酶活力達到 851.13 U／L，較優(yōu)化前提高了65.2％。

五、二次正交旋轉(zhuǎn)組合法

前面介紹的幾種方法具有試驗設(shè)計和結(jié)果分析簡單、實際應(yīng)用效果好的優(yōu)點，在微生物培養(yǎng)基優(yōu)化中得到了廣泛的應(yīng)用，但它們不能對各組分進行定量分析，不能對產(chǎn)量進行預(yù)測。所以，在正交設(shè)計試驗法的基礎(chǔ)上，加入組合設(shè)計和旋轉(zhuǎn)設(shè)計的思想，并與回歸分析方法有機結(jié)合，建立了二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法(rotation regression orthogonal combination)，它是旋轉(zhuǎn)設(shè)計的一種，不僅基本保留了回歸正交設(shè)計的優(yōu)點，還能根據(jù)測量值直接尋求最優(yōu)區(qū)域，適用于分析參試因子的交互作用。它既能分析各因子的影響，又能建立定量的數(shù)學模型，屬更高層次的試驗設(shè)計技術(shù)�；�本思路是利用回歸設(shè)計安排試驗，對試驗結(jié)果用方程擬合，得到數(shù)學模型，利用計算機對模型進行圖形模擬或數(shù)學模擬，求得模型的最優(yōu)解和相應(yīng)的培養(yǎng)基配方，并在一定范 圍內(nèi)預(yù)估出在最佳方案時的產(chǎn)量，與響應(yīng)面法有相似之處。張鐘元等人為了提高 Proteus mirabilis產(chǎn) L-肉堿脫水酶的活力，通過單因素試驗研究了碳源、氮源及誘導物等對酶生物合成的影響的基礎(chǔ)上，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化了培養(yǎng)基組分配比，使L-肉堿脫水酶活力由最初的1.90 U／mL提高到了5.32 U／mL，與模型預(yù)測值較為接近，取得了預(yù)期效果。劉曉永等人為提高酵母菌中β- 葡聚糖的含量，在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用二次正交旋轉(zhuǎn)組合法設(shè)計培養(yǎng)基成分，獲得了優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后，酵母菌中B一葡聚糖產(chǎn)量由原來的65.80 mg／100 mL提高至108.18mg／100 mL，獲得了滿意的結(jié)果。

六、遺傳算法與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

遺傳算法(genetic algorithms，GA)是一新型智能優(yōu)化算法，由美國的Holland提出，是進化算法(evolutionary algorithms，EA)中的一種，是基于達爾文的進化論和孟德爾的遺傳學說，仿效生物的進化與遺傳，根據(jù)“生存競爭” 和“優(yōu)勝劣汰”的原則，借助復(fù)制、交換、突變等操作，使所要解決的問題從初始解一步步逼近最優(yōu)解，遺傳算法模擬生物遺傳和進化原理，在反復(fù)迭代的過程中，將適應(yīng)度高的個體更多的遺傳到下一代，為確保在整個n維空間搜索最優(yōu)解，群體由一定數(shù)量的個體組成，在遺傳的同時，個體在一定的概率下發(fā)生交叉互換，并在一定的概率下發(fā)生變異，所以，將在最終的群體中得到一個或若干個優(yōu)良的個體，其對應(yīng)的表現(xiàn)型即為達到或接近問題的最優(yōu)解，培養(yǎng)基配方優(yōu)化的遺傳算法基本過程見圖 l，遺傳算法在整個可行域內(nèi)進行隨機尋優(yōu)，并對搜索空間的多個解進行評估，能有效防止搜索過程限于局部最優(yōu)解，最終達到或逼近全局最優(yōu)解。最早報道 GA應(yīng)用于培養(yǎng)基優(yōu)化的是 Freyer等，其后 Zuzek等也進行了嘗試，由于它在培養(yǎng)基優(yōu)化方面不需要建立數(shù)學模型確定各因素之間的相互影響，有目標函數(shù)值即可的優(yōu)越性而受青睞。與其他傳統(tǒng)搜索方法相比，GA在搜索過程中不易陷入局部最優(yōu)，即使所定義的目標函數(shù)非連續(xù)、不規(guī)則或伴有噪聲，它也能以很大的概率找到全局最優(yōu)解，同時，由于GA 固有的并行性，使得它適合于大規(guī)模的并行分布處理，而且GA容易介入到已有的模型中并且具有可擴展性，易于和其他技術(shù)如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、模糊推理、混沌行為和人工生命等相結(jié)合，形成性能更優(yōu)的問題求解方法∞。運用配方優(yōu)化的遺傳算法所搜索出的決策因素最優(yōu)區(qū)間，可以免饋到進一步的配方試驗中，有效地縮短確定優(yōu)化配方的時間與減少試驗次數(shù)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種“黑箱”模型，具有很強的非線性映射能力，可用于反 映非線性條件下，難以用常規(guī)的數(shù)學模型描述的問題。遺傳算法以自然選擇和遺傳理論為基礎(chǔ)，將生物進化過程 中適者生存規(guī)則與群體內(nèi)部染色體的隨機信息交換機制相結(jié)合的高效全局尋優(yōu)搜索算法。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的結(jié)合可 以通過引入非線性的模型來描述各因素問復(fù)雜的關(guān)系，并在遺傳算法的基礎(chǔ)上，通過全局尋優(yōu)找出最佳值。羅劍飛等人利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)和遺傳算法(GA)結(jié)合的優(yōu)化方法優(yōu)化了培養(yǎng)其組成，并獲得了最高“性價比”的培養(yǎng)基，通過發(fā)酵經(jīng)濟學的初步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基比初始培養(yǎng)基，其“性價比”提高了27.36％。試驗表明，通過優(yōu)化可以大大減少生產(chǎn)中的成本消耗。宋文軍等應(yīng)用GA優(yōu)化了L—Ile發(fā)酵培養(yǎng)基組成，并運用ANN技術(shù)對發(fā)酵過程進行建模并預(yù)測 ，取得了良好效果，實驗發(fā)現(xiàn)，在L—Ile 發(fā)酵的模擬和預(yù)測是一種快速方法。

七、模式識別

模式識別方法是從空間區(qū)域劃分和屬性類別判斷角度出發(fā)，處理多元數(shù)據(jù)的一種非函數(shù)方法。該方法用一組表示被研究對象特征的變量構(gòu)成模式空間，按 “物以類聚”的觀點分析數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，劃分出具有特定屬性模式類別的空間聚集區(qū)域 ，并辨認每一個模式的類別。由計算機按模式識別原理處理數(shù)據(jù)信息，做出最優(yōu)決策。熊明勇等人應(yīng)用模式識別，以培養(yǎng)基組成構(gòu)筑模式空間，以黃色短桿菌 TV10為出發(fā)菌株，通過主成分分析(PCA)揭示模式空間的可視化區(qū)域，選擇優(yōu)化點并逆推回到高維空間得到最優(yōu)化培養(yǎng)基組成，結(jié)果表明，該菌株可積累一纈氨酸26.38 g／L，比初始值提高7.8％。

八、展望

微生物初級代謝產(chǎn)物和次級代謝的生物合成其發(fā)酵機理十分復(fù)雜，受很多因素的影響，如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、pH、發(fā)酵時間、菌種理化特性及發(fā)酵工藝等。適宜的培養(yǎng)基配方和合適的發(fā)酵條件成為產(chǎn)物生成量高低和原料利用率高低的決定因素。一般情況下，培養(yǎng)基組分繁多且各成分間還可能存在錯綜復(fù)雜的交互作用。因此，微生物培養(yǎng)基的組成優(yōu)化就顯得十分重要和必要。培養(yǎng)基優(yōu)化常規(guī)方法有單因素試驗法、正交設(shè)計試驗法及響應(yīng)面分析法，還有一些實踐應(yīng)用相對較少的，如均勻設(shè)計法、二次回歸旋轉(zhuǎn)組合法、遺傳算法等。培養(yǎng)基優(yōu)化方法的選擇，可以采取單一方法 ，也可以用幾種方法的組合，要根據(jù)實際情況合理選擇。培養(yǎng)基優(yōu)化方法除本文中提到的常用培養(yǎng)基優(yōu)化方法外，還有研究者不斷開拓新方法或采用不同方法交叉對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，如聚類分析方法等。筆者相信，隨著數(shù)理統(tǒng)計方法和優(yōu)化技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將來一定還會出現(xiàn)更適用、更方便、可行性更好的微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法。