云序circRNA+m6A組合服務(wù)在多個修飾譜學發(fā)表的應(yīng)用

研究背景

目前m6A修飾的研究如火如荼，共計發(fā)表文章已達3000+篇，且每年仍呈指數(shù)上漲的趨勢。針對m6A的研究主要包括兩大方面：（1）編碼RNA上m6A修飾調(diào)控表達；（2）非編碼RNA（包括lncRNA、circRNA、miRNA等）中m6A修飾調(diào)控下游表達。然而非編碼RNA發(fā)表的文獻還較少，目前針對非編碼RNA的研究仍具有非常廣闊的空間。云序生物現(xiàn)已發(fā)表多篇非編碼RNA研究文章，這次我們以云序客戶發(fā)表的circRNA+m6A方向文章為例，幫助老師掌握短平快發(fā)表5分circRNA修飾譜學文章思路。
 
案例解析
  發(fā)表期刊：Journal of Cellular and Molecular Medicine
發(fā)表日期：2021年6月27日
影響因子：5.109
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Identification and characterization of N6-methyladenosine modification of circRNAs in glioblastoma
實驗背景：
膠質(zhì)瘤是一種常見的腦腫瘤，約占所有原發(fā)性腦腫瘤的80%。最近的表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，RNA轉(zhuǎn)錄后修飾在調(diào)節(jié)細胞生長和代謝以及腫瘤的生物學行為中起著至關(guān)重要的作用。然而circRNA的m6A修飾在GBM發(fā)病機制中的作用仍然不清楚。
實驗設(shè)計：
本文通過m6A MeRIP-seq結(jié)合RNA-seq，分析了環(huán)狀RNA中m6A修飾在膠質(zhì)瘤發(fā)展進程中的調(diào)控機制。本文思路設(shè)計如下：
  實驗結(jié)果：
（1）甲基化水平整體分析 （2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發(fā)生差異甲基化修飾的circRNA，采用散點圖展示了差異甲基化修飾的circRNA。此外也分別展示了差異峰所在circRNA的基因組分布、長度分布以及染色體分布等信息。
  （3）m6A MeRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析
通過兩組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)在m6A修飾水平改變的基因中，有1298個表達上調(diào)，1905個下調(diào)。且m6A水平與circRNA表達呈正相關(guān)。分別采用散點圖、熱圖等展示了既發(fā)生差異甲基化又發(fā)生差異表達的基因。
  （4）功能富集分析
分別對差異（上調(diào)或下調(diào)）的甲基化circRNA的來源基因進行GO和KEGG功能富集分析，從而從生物學功能的方向找出m6A修飾circRNA可能參與的功能通路，從生物學功能的角度解析m6A修飾circRNA對膠質(zhì)瘤進程的調(diào)控。
  （5）指標驗證
此外，本文通過MeRIP-qPCR驗證并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)鑒定了5個相關(guān)分子（BUB1、C1S、DTHD1、F13A1和NDC80），這些分子可能是進一步研究m6A介導GBM發(fā)展的功能和機制的初步候選分子。
    發(fā)表期刊：BMC Genomics
發(fā)表日期：2020年1月13日
影響因子：3.969
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Transcriptome-wide map of m6A circRNAs identified in a rat model of hypoxia mediated pulmonary hypertension
實驗背景：
低氧介導肺動脈高壓（HPH）是一種致命性疾病，目前尚無有效的治療方法。近期研究發(fā)現(xiàn)circRNA受m6A修飾的調(diào)控，而circRNA的m6A修飾在HPH中作用仍不清楚。
實驗設(shè)計：
本文通過m6A MeRIP-seq結(jié)合RNA-seq，分析了環(huán)狀RNA中m6A修飾在HPH中的調(diào)控機制。本文思路設(shè)計如下： 實驗結(jié)果：
（1）甲基化水平整體分析
m6A MeRIP-seq測序后采用熱圖展示了每個樣品中基因甲基化修飾水平，箱圖從整體上展示了正常組樣品和HPH組樣品中的甲基化水平。m6A修飾在環(huán)狀RNA類型上的偏好性以及每個circRNA外顯子上m6A修飾的位點數(shù)也做了餅圖和柱狀圖的展示。這部分結(jié)果從整體上展示了正常組織和HPH組織circRNA上m6A的修飾情況，為后續(xù)研究進行鋪墊。

（2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發(fā)生差異甲基化修飾的circRNA，針對上調(diào)、下調(diào)相關(guān)circRNA進行長度及染色體分布特征分析，并分別用韋恩圖、散點圖以及累計分布圖展示了兩組間差異甲基化修飾情況。為篩選靶標基因提供基礎(chǔ)。 （3）m6A MeRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析
通過兩組學聯(lián)合分析采用散點圖展示了既發(fā)生差異甲基化又發(fā)生差異表達的基因情況。針對上述circRNA來源基因進行了GO和KEGG富集分析，將m6A修飾差異且表達差異的circRNA來源基因轉(zhuǎn)化為具有生物學意義的通路富集基因，從而進一步對其功能進行了解，有利于后續(xù)指標的篩選。 （4）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
為探索受m6A修飾調(diào)控的circRNA的作用機制，研究者從與PH過程有關(guān)的miRNA入手進行了 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，從而確定了兩個與研究密切相關(guān)的circXpo6和circTmtc3。 （5）指標驗證
為確定circRNA在兩組間差異表達且發(fā)生差異m6A修飾，作者進行了circRNA結(jié)構(gòu)及表達量鑒定，此外通過MeRIP-qPCR對其修飾水平也進行了鑒定。這一結(jié)果說明m6A修飾調(diào)控的circRNA的表達可能參與到HPH的發(fā)展過程中。

云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉(zhuǎn)錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測序
• m6A  miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準高效，可以實現(xiàn)一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
 MeRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制