MeRIP-qPCR方法原理、結(jié)果含義、展示方法及應(yīng)用細(xì)談

m6A等RNA修飾的主要研究手段是通過MeRIP方法對(duì)發(fā)生修飾的片段進(jìn)行富集，其后進(jìn)行高通量測(cè)序分析修飾位點(diǎn)。而無論是一篇僅展示修飾位點(diǎn)分布特點(diǎn)的譜學(xué)文章，還是深入研究修飾調(diào)控基因表達(dá)機(jī)制的文章，在高通量測(cè)序這一步之后，通常都需要對(duì)篩選出來的部分修飾位點(diǎn)進(jìn)行低通量的MeRIP-qPCR驗(yàn)證。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說來簡單卻必不可少，對(duì)于剛剛接觸RNA修飾研究的小伙伴來說，可能會(huì)對(duì)MeRIP-qPCR的方法原理、結(jié)果含義、展示方法等有一些疑問，而看文章中又常常是幾句話帶過，無法解答心中的困惑，看過仍然對(duì)自己手里的數(shù)字一頭霧水。這次我們就在這里詳細(xì)談一談MeRIP-qPCR相關(guān)問題。

1.MeRIP-qPCR的目的是什么？
首先我們需要明確的是，MeRIP-qPCR的目的是驗(yàn)證某個(gè)目標(biāo)基因上的某個(gè)修飾位點(diǎn)（以一小段區(qū)域的形式，MeRIP法精確不到單堿基）的修飾水平。
得到的結(jié)果往往是一個(gè)%（IP/Input）的數(shù)值，它體現(xiàn)的是該位點(diǎn)的修飾水平（可以大致理解為：這個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)了很多條，其中百分之多少是這個(gè)位點(diǎn)有修飾的？）需要與普通qPCR驗(yàn)證基因表達(dá)水平（可以大致理解為：這個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)了多少條？）的目的區(qū)分開。
 
2.MeRIP-qPCR的實(shí)驗(yàn)方法？
MeRIP-qPCR就是MeRIP實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行一個(gè)qPCR。
這里的MeRIP實(shí)驗(yàn)同MeRIP-seq測(cè)序中的其實(shí)相同：對(duì)RNA進(jìn)行片段化。然后每個(gè)樣品一分為二，一部分片段用針對(duì)該修飾的特異性抗體與RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀(IP)，留為IP樣品，另一部分不進(jìn)行IP直接留作Input樣品。之后對(duì)兩部分RNA片段分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR。如果是測(cè)序，就是在這里把緊接的qPCR改為接建庫測(cè)序。
 
3.MeRIP-qPCR引物如何設(shè)計(jì)？
由于目的是定量位點(diǎn)的修飾水平，因此MeRIP-qPCR的引物不僅是針對(duì)目標(biāo)基因，還要是針對(duì)其上的那個(gè)修飾位點(diǎn)（區(qū)域）。這個(gè)位點(diǎn)信息可以從：

（1）MeRIP-seq的測(cè)序結(jié)果中篩選得來
通常是一段位置坐標(biāo)，比如云序生物提供的MeRIP-seq結(jié)果，某個(gè)甲基化峰位置如：chr1:111234-111567。有了這個(gè)位置信息，可以去UCSC genome browser網(wǎng)站:
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway選對(duì)應(yīng)的基因組版本獲取這段序列。
 

（2）網(wǎng)站預(yù)測(cè)得到
如果沒有測(cè)序，想先通過MeRIP-qPCR看看關(guān)注的某基因上是否可能存在修飾，就只能預(yù)測(cè)一下發(fā)生修飾概率高的區(qū)域位置。通常這些網(wǎng)站是基于研究公認(rèn)的該種修飾motif序列等進(jìn)行預(yù)測(cè)，需要將目標(biāo)RNA的序列輸入，可生成預(yù)測(cè)結(jié)果。

m6A RNA甲基化預(yù)測(cè)網(wǎng)站：
http://www.cuilab.cn/sramp/
m5C RNA甲基化預(yù)測(cè)網(wǎng)站：
http://www.rnanut.net/rnam5cfinder/
 
4.MeRIP-qPCR為什么沒有內(nèi)參基因？
（1）MeRIP-qPCR不需要內(nèi)參來進(jìn)行樣本間的均一化矯正
從結(jié)果的形式%（IP/Input）我們也可以看到，這個(gè)實(shí)驗(yàn)側(cè)重看修飾的片段（IP樣品qPCR結(jié)果）占總片段（Input樣品qPCR結(jié)果）的比例，實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹皇且�得到這兩者的比值就體現(xiàn)修飾水平，因此MeRIP-qPCR不涉及到普通的相對(duì)定量qPCR需要的內(nèi)參：
內(nèi)參是衡量不同樣品間表達(dá)量時(shí)用來均一化樣品的，比如默認(rèn)GAPDH在你的各個(gè)樣本之間表達(dá)量應(yīng)當(dāng)相同，qPCR結(jié)果樣品A中目的基因表達(dá)量1，GAPDH表達(dá)量10；樣品B中目的基因表達(dá)量1.5，GAPDH表達(dá)量15，那么不能說因?yàn)?<1.5所以就說A樣品目的基因表達(dá)量低，因?yàn)閺腉APDH來看可能只是實(shí)驗(yàn)?zāi)抄h(huán)節(jié)中A樣品的量整體少了一些而已。而是要看A中目的基因表達(dá)量是GAPDH的0.1倍，B也是0.1倍，兩樣品中目的基因表達(dá)量其實(shí)無差別。

換做MeRIP-qPCR中，如果針對(duì)目的基因目的位點(diǎn)qPCR，樣品A的IP結(jié)果0.2，Input結(jié)果1；樣品B的IP結(jié)果0.3，Input結(jié)果1.5，我們的%（IP/Input）結(jié)果顯示兩個(gè)樣品甲基化水平數(shù)值都是0.2，修飾水平無差異，到此就完成了目的。

有人問那沒有做內(nèi)參，萬一發(fā)生如上段提到的樣品用量等環(huán)節(jié)有差異，會(huì)不會(huì)影響修飾水平的比較？顯然，如果兩個(gè)樣品本來修飾水平相同，那么夸張地想，即使B樣品用量由于手抖加了A的10倍，qPCR結(jié)果也會(huì)IP和Input信號(hào)都增長10倍，不影響這個(gè)比值即修飾水平。
  （2）沒有公認(rèn)在不同樣品中修飾水平都會(huì)穩(wěn)定的基因可做參照
前面第1點(diǎn)主要從多個(gè)樣品比較的角度解釋了MeRIP-qPCR為何不需要內(nèi)參基因。
而有時(shí)出現(xiàn)以下情況：1）沒有分組對(duì)比，只想看下這一個(gè)（組）樣品中該基因算不算有修飾，此時(shí)有個(gè)疑問：結(jié)果的%（IP/Input）達(dá)到多少可算作有修飾？——回答是目前沒有一個(gè)定值。那么此時(shí)難免會(huì)希望能有個(gè)已知有修飾的參考基因，我們的目的基因如果水平接近或者超過就算有修飾。2）想看看MeRIP實(shí)驗(yàn)體系有沒有問題，做個(gè)已知有修飾的基因當(dāng)陽性對(duì)照看看效果。然而RNA修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆的酶促反應(yīng)，在同個(gè)組織細(xì)胞中的水平可能都會(huì)隨著環(huán)境千變?nèi)f化，不同組織中更是差別很大，與普通qPCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)能找到穩(wěn)定表達(dá)的看家基因不同，MeRIP-qPCR沒有一個(gè)穩(wěn)定修飾的基因做參照，目前RNA修飾文章也都不要求有這種參照。

針對(duì)上述目的1），可以同時(shí)多做一個(gè)非特異性IgG抗體的免疫沉淀富集，對(duì)比樣品本身的IP和IgG是否有顯著差異，放在文章中作為該位點(diǎn)有一定程度的修飾的證據(jù)。

針對(duì)目的2），也可做IgG對(duì)照檢測(cè)體系的特異性。除此之外，云序生物代理的GenSeq m6A MeRIP試劑盒中除了提供了IgG抗體，還提供了一對(duì)m6A的陽參和一對(duì)陰參引物，是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的，靶向 HEK293 細(xì)胞中 m6A 修飾的某段 RNA 區(qū)域（Positive Primers）和無 m6A 修飾的某段 RNA 區(qū)域（Negative Primers）， 供有條件且感興趣的用戶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)效率和抗體特異性。但如前面所說，m6A 修飾具有很強(qiáng)的細(xì)胞類型特異性，無法保證在任何細(xì)胞系或樣品中，該引物都能作為很好的參照。因此，建議想對(duì)實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行進(jìn)一步自驗(yàn)證的用戶，采用 HEK293 細(xì)胞的 RNA 進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
 
5.MeRIP-qPCR不能看出基因表達(dá)量？
有人想：Input樣品又沒經(jīng)過IP，qPCR操作不就與普通qPCR沒什么差別，那么做了MeRIP-qPCR，不能得到基因表達(dá)量的結(jié)果嗎？比如前面MeRIP-qPCR例子中A和B樣品Input分別是1和1.5的結(jié)果可以用來看一下這個(gè)基因在兩樣品中的表達(dá)量有沒有差異？——我們不知道，因?yàn)闆]有GAPDH等內(nèi)參基因來計(jì)算，要看表達(dá)量的話就不知道1和1.5的差異是否是如前一段那樣由于用量差異等因素帶來的了。因此通常說起MeRIP-qPCR，結(jié)果不能用來體現(xiàn)基因表達(dá)量。
那如果在MeRIP-qPCR步驟中直接多擴(kuò)增一個(gè)GAPDH基因，與目的基因Input聯(lián)合在一起定量表達(dá)量是否可行？我們只能說可以參考，不過由于MeRIP實(shí)驗(yàn)是有片段化這一步驟的，PCR信號(hào)會(huì)弱一些，對(duì)于驗(yàn)證表達(dá)量的目的來說還是推薦采用常規(guī)的qPCR步驟會(huì)更準(zhǔn)確、風(fēng)險(xiǎn)更小。
 
6.IP/Input/IgG傻傻分不清：我需要做哪些、如何展示？
前面1.和2.兩個(gè)環(huán)節(jié)談到過，IP是用該修飾的特異性抗體，通過免疫共沉淀富集帶修飾的片段，Input是不進(jìn)行富集的所有片段，這兩個(gè)是MeRIP-qPCR必做的，每個(gè)樣品分別做了這兩部分的PCR結(jié)果合起來計(jì)算才能體現(xiàn)修飾水平，達(dá)到實(shí)驗(yàn)的目的。而IgG如4（2）提到，是用非特異性抗體，通過免疫共沉淀富集非特異性結(jié)合的片段，作為對(duì)IP的對(duì)照，證明IP的信號(hào)不是源自抗體非特異性和，而是確實(shí)是針對(duì)發(fā)生修飾的片段。IgG可以選做。MeRIP-qPCR結(jié)果通常用柱狀圖展示即可，常見的如以下3種情況：

（1）只做IP和Input：展示%（IP/Input）值
如果有兩組樣品，展示一個(gè)目的基因在兩組的修飾水平。或者一組樣品，展示多個(gè)基因的修飾水平差異，可以只做IP和Input，展示%（IP/Input）值。[1][2] （2）做IP、IgG和Input：展示%（IP/Input）值、%（IgG/Input）值
如果為了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖C明實(shí)驗(yàn)體系沒有問題，或者驗(yàn)證指標(biāo)只有一個(gè)分組/一個(gè)基因但需要一個(gè)對(duì)照，可以同時(shí)多做一個(gè)IgG，結(jié)果展示%（IP/Input）和%（IgG/Input）兩個(gè)柱子對(duì)照。[5][6]
 
 
（3）做IP、IgG和Input：展示Fold enrichment值（%（IP/Input）和%（IgG/Input）的比值）
如果做了IgG對(duì)照，還可以選擇用Fold Enrichment來展示，富集倍數(shù)%(IP/Input)/%( IgG/Input)，即IP比對(duì)照的IgG信號(hào)高多少倍，也可以用來體現(xiàn)修飾的水平。通常是分組和基因都是多個(gè)時(shí)不想一一單獨(dú)展示IgG。[7]
 
*以上圖參考文獻(xiàn)：
[1] Liu, L. , Wang, J. , Sun, G. , Wu, Q. , & Pan, Q. . (2019). M6a mrna methylation regulates ctnnb1 to promote the proliferation of hepatoblastoma. Molecular Cancer, 18(1).
[2] Tong, J. ,  Wang, X. ,  Liu, Y. ,  Ren, X. ,  Wang, A. , &  Chen, Z. , et al. Pooled crispr screening identifies m 6 a as a positive regulator of macrophage activation. Science advances, 7(18), eabd4742.
[3] Yin, H. ,  Zhang, X. ,  Yang, P. ,  Zhang, X. , &  Zhang, R. . (2021). Rna m6a methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming. Nature Communications, 12(1).
[4] Yang, X. ,  Shao, F. ,  D  Guo,  Wang, W. , &  Lu, Z. . (2021). Wnt/β-catenin-suppressed fto expression increases m6a of c-myc mrna to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis. Cell Death & Disease, 12(5).
[5] Wang, W. ,  Shao, F. ,  Yang, X. ,  Wang, J. , &  Lu, Z. . (2021). METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding. Nature Communications.
[6]Chen, C. ,  Liu, W. ,  Guo, J. ,  Y  Liu, &  Gao, S. . (2021). Nuclear m6a reader ythdc1 regulates the scaffold function of line1 rna in mouse escs and early embryos. Protein & Cell(7849).
[7] Zhou, B. ,  Liu, C. ,  Xu, L. ,  Yuan, Y. , &  Ma, X. . (2020). N 6 -methyladenosine reader protein ythdc2 suppresses liver steatosis via regulation of mrna stability of lipogenic genes. Hepatology.

7.MeRIP-qPCR結(jié)果的計(jì)算？
MeRIP-qPCR結(jié)果計(jì)算如下表: *其中DF和IF分別是稀釋倍數(shù)。是說一個(gè)樣品，由于其中IP到的RNA量一定會(huì)比不IP直接保留的Input的RNA量少很多，IP和Input實(shí)際取來做逆轉(zhuǎn)錄+qPCR的模板稀釋倍數(shù)不同，因此要把這個(gè)倍數(shù)考慮進(jìn)去。比如15μg的片段化RNA經(jīng)過IP后的RNA全部拿去做IP樣品的qPCR實(shí)驗(yàn)得到Ct值A(chǔ)1, 另3μg的片段化RNA用來作為Input樣品qPCR得到Ct值B1，則%(IP/Input)=2(B1-A1)*（3/15）*100。IgG/Input的計(jì)算也是同理。
 
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6ARNA修飾測(cè)序
m6A RNA修飾測(cè)序（m6A-meRIP-seq）
對(duì)m6A RNA甲基化，目前流行的檢測(cè)手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測(cè)序：
●  m6A 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
●  m6A LncRNA測(cè)序（涵蓋LncRNA和mRNA）
●  m6A Pri-miRNA測(cè)序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
●  m6A  mRNA測(cè)序
●  m6A  miRNA測(cè)序

02 檢測(cè)整體m6ARNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類修飾水平檢測(cè)，一步到位。
比色法檢測(cè)整體RNA修飾水平
快速檢測(cè)m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。

05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。