單細(xì)胞技術(shù)對于腫瘤研究的作用

引言
單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為揭開腫瘤的神秘面紗提供了新的手段。運用單細(xì)胞技術(shù)，能讓我們從腫瘤的哪些角度入手，來解決哪些具體的問題呢？SBC與您分享“Decoding Cancer Biology One Cell at a Time”。

 

對于腫瘤研究來說，可以從基因組不穩(wěn)定、不受限制的復(fù)制潛力、細(xì)胞能量調(diào)節(jié)的失常、織織侵襲和轉(zhuǎn)移、持續(xù)的血管生成、促進腫瘤的炎癥和逃避免疫攻擊等特征進行闡述。雖然大部分的腫瘤包含以上特征，但是，隨著研究的深入，人們越來越認(rèn)識到，對腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞亞群的認(rèn)知至關(guān)重要。比如，腫瘤的不受限復(fù)制是由未分化的細(xì)胞亞群（腫瘤干細(xì)胞）所驅(qū)動；侵襲和轉(zhuǎn)移可能是由上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的激活或者其他侵襲相關(guān)的細(xì)胞引起；細(xì)胞的能量失調(diào)及持續(xù)的血管生成可能由腫瘤特定區(qū)域的，如經(jīng)歷缺氧和缺乏營養(yǎng)的細(xì)胞驅(qū)動；而腫瘤免疫逃逸可能也是由特定區(qū)域的細(xì)胞增強了免疫浸潤引起。因此，對腫瘤亞群的了解有助于腫瘤亞型的識別，特別是在治療或者治療復(fù)發(fā)過程中的作用。

 

通過治療消除癌細(xì)胞，但在隨后出現(xiàn)了復(fù)發(fā)表明了腫瘤內(nèi)部客觀的異質(zhì)性（intratumoral heterogeneity，ITH）存在。傳統(tǒng)的基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對腫瘤的研究，只能揭示聚集的混合細(xì)胞的特征，而掩蓋了ITH，單細(xì)胞“組學(xué)”的出現(xiàn)，為我們?nèi)�面描述腫瘤的內(nèi)部特征鋪平了道路。那么，具體在哪些研究角度和層面，單細(xì)胞技術(shù)對于腫瘤研究能發(fā)揮它的一技之長呢？

 

 

 

 

隨著近年來的技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)從基因組，轉(zhuǎn)錄組，甲基化，染色質(zhì)可及性，細(xì)胞表面/胞內(nèi)蛋白角度進行單細(xì)胞研究。雖然從單個細(xì)胞的DNA測序去識別突變信息有一定難度，但是從拷貝數(shù)變異（CNA）角度進行分析還是能得到比較可靠和有用的數(shù)據(jù)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）是現(xiàn)有運用的最廣的進行腫瘤ITH研究的工具。通過該方法，既能從功能上，也能從遺傳信息上進行分析。當(dāng)然，最新的方法，除了常規(guī)的基因表達檢測之外，已經(jīng)能實現(xiàn)融合基因的檢測，也能同時進行DNA和RNA的檢測或者甲基化和轉(zhuǎn)錄組的檢測。

 

盡管大部分的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序需要新鮮樣本進行實驗，但是，通過對冰凍組織進行提核（snRNA-seq/sNuc-seq）來進行實驗為臨床腫瘤樣本的利用提供了方案。這也將為在臨床情景下，更廣泛地對有時間跨度樣本進行檢測，以對腫瘤發(fā)展過程和對治療的療效進行評估提供了可能。

 

 

 

利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，能實現(xiàn)細(xì)胞亞群的分類，結(jié)合對每個類群中上調(diào)基因的解讀可以對細(xì)胞的類型進行注釋。然而，腫瘤樣本的解讀會面臨挑戰(zhàn)：把惡性細(xì)胞（可能由遺傳變異）和非惡性細(xì)胞（基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞）進行區(qū)分。因此，將基因表達信息和遺傳變異信息的聯(lián)合為解決該問題提供了一種可行方案。通常來說，現(xiàn)有的研究通過識別帶有CNAs的細(xì)胞來識別惡性細(xì)胞，也以此來鑒定惡性細(xì)胞中的不同遺傳背景亞型。

 

當(dāng)然，由于單細(xì)胞技術(shù)對于基因突變檢出和基因表達檢測的局限，通過對更多基因信息或者結(jié)合多個基因的基因集角度來對細(xì)胞類型鑒定會更加準(zhǔn)確。

 

對腫瘤內(nèi)的細(xì)胞異質(zhì)性的解讀通常從兩個方面入手：1）不同的細(xì)胞分屬于哪些具體的細(xì)胞類型；2）每個細(xì)胞類型是否能反映出不同的細(xì)胞“狀態(tài)”。分析細(xì)胞周期相關(guān)的基因集是常用的對細(xì)胞不同狀態(tài)進行分類的方法。雖然不夠精確，這種分析還是能對細(xì)胞周期激活或者非激活狀態(tài)的細(xì)胞狀態(tài)進行了區(qū)分。

 

 

 

 

腫瘤干細(xì)胞模型是腫瘤發(fā)展進程的基礎(chǔ)，該模型認(rèn)為腫瘤包含自我更新細(xì)胞亞群（某種情況下會引起對治療的抵抗）和其他分化程度更高的細(xì)胞類型。利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序提供的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了腫瘤發(fā)展過程中不同狀態(tài)的細(xì)胞類型，也發(fā)現(xiàn)了腫瘤中的細(xì)胞發(fā)展過程與正常細(xì)胞發(fā)育的相似性。

 

比如，在IDH突變的膠質(zhì)瘤中鑒定到的細(xì)胞類型跟神經(jīng)本身的發(fā)育狀態(tài)相似。其中有一種神經(jīng)祖細(xì)胞類型（NPC-like），為細(xì)胞周期激活細(xì)胞，是沿著星形膠質(zhì)類似（AC-like）或者少突細(xì)胞類似（OC-like）世系發(fā)展的非增值分化細(xì)胞。這種現(xiàn)象同樣在其他的如黑色素瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，髓母細(xì)胞瘤和多種類型肺癌中發(fā)現(xiàn)。這些研究一方面證明了正常發(fā)育與腫瘤發(fā)展過程的相似性，同樣也說明了腫瘤發(fā)展過程與正常分化過程中的差異。

比如，通過單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)了在治療壓力下，可能發(fā)生細(xì)胞向較早狀態(tài)的細(xì)胞狀態(tài)過渡。用BRAF抑制劑威羅非尼治療后，源自患者的BRAFV600突變的黑素瘤細(xì)胞系在治療三天后，顯示向原始神經(jīng)crest-like表型過渡，其中神經(jīng)生長因子受體的表達升高，黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子MITF的表達降低。這種向早期發(fā)育表型的轉(zhuǎn)變被認(rèn)為是耐藥性適應(yīng)的結(jié)果。

 

腫瘤研究的一個重點內(nèi)容是鑒定不同的疾病亞型以進行針對性的治療。利用普通的腫瘤基因表達數(shù)據(jù)很難實現(xiàn)這一目標(biāo)�；�于單細(xì)胞的分析為腫瘤分類提供了兩方面的重要內(nèi)容：1.通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)得到的亞群來反映傳統(tǒng)分類，這也表明現(xiàn)有分類的基礎(chǔ)也是某類細(xì)胞占比；2. 通過描述特定細(xì)胞類型的作用及其相互作用，對廣譜大分類的生物學(xué)結(jié)論提供新的認(rèn)識。在黑素瘤中，常規(guī)認(rèn)知將腫瘤分類為MITF高或AXL高，但單細(xì)胞分析顯示兩種細(xì)胞狀態(tài)均在單個腫瘤中出現(xiàn)。值得注意的是，AXL高表達腫瘤中也會出現(xiàn)腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞（CAF）的高表達，說明AXL也會與其他相關(guān)的基因同時在腫瘤里表達豐度較高。同樣地，這種現(xiàn)象在結(jié)腸癌，頭頸鱗狀細(xì)胞癌，卵巢癌中出現(xiàn)。因此，通過單細(xì)胞技術(shù)，既能發(fā)現(xiàn)腫瘤中的特殊惡性細(xì)胞，也能找到其他類型的非惡性細(xì)胞，這將為腫瘤的再次深入分型提供依據(jù)。
 

 

腫瘤微環(huán)境（TME）的組成通過復(fù)雜的機制影響了腫瘤過程和治療應(yīng)答。腫瘤微環(huán)境細(xì)胞包括T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞之間的互作溝通是實現(xiàn)生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。通過單細(xì)胞檢測，可以盡可能地了解腫瘤內(nèi)生態(tài)的詳細(xì)組成。

 

CD8⁺效應(yīng)T細(xì)胞可以裂解惡性細(xì)胞，但是，可能至少有兩個不同的機制會導(dǎo)致其功能減弱：首先，慢性抗原刺激可能導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，喪失效應(yīng)能力；其次，通過一系列復(fù)雜的機制，包括與其他TME成分（例如CAF，內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的相互作用，可以將“浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞（TIL）”從腫瘤核心“排除”。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序提供了一種可能，通過剖析TME組成，探究耗竭特異基因的表達特征并確定免疫排斥的潛在機制。此外，通過單細(xì)胞免疫組庫分析，還能發(fā)現(xiàn)不同的T cell亞克隆。通過對黑色素瘤的單細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)了與T細(xì)胞活化，與患者腫瘤消退或進展相關(guān)的不同CD8⁺T細(xì)胞狀態(tài)和特征基因，及T細(xì)胞被惡性細(xì)胞耗竭，預(yù)測對免疫檢查點抑制劑治療的反應(yīng)。

d. 腫瘤微環(huán)境和免疫治療應(yīng)答   

 

腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是大多數(shù)死亡的重要原因。因此，通過單細(xì)胞技術(shù)，能為我們從不同的角度增加對轉(zhuǎn)移的認(rèn)識：

（1）對促進轉(zhuǎn)移的細(xì)胞狀態(tài)的特征了解；

（2）對配對的原位癌和轉(zhuǎn)移癌組成的了解；

（3）對循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的分析。

 

EMT是發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要特征，雖然帶有一定的爭議。但是，通過對HNSCC的單細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤浸潤邊緣發(fā)現(xiàn)了EMT-like激活信號，同時是受到CAF調(diào)控并在轉(zhuǎn)移患者中大量存在。其他的研究也得到了相近的結(jié)論。因此，針對EMT與轉(zhuǎn)移的爭論可能在不久的將來會有定論。

 

利用單細(xì)胞技術(shù)對CTCs細(xì)胞的研究，將有助于對轉(zhuǎn)移早期階段的理解。通過分析乳腺癌CTCs，發(fā)現(xiàn)了豐富的CTC亞群，并顯示出顯著的轉(zhuǎn)移潛力。對CTC亞群的特征分析表明，粘連相關(guān)蛋白的基因表達上調(diào)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強了。

 

通過對配對的原位癌和轉(zhuǎn)移癌樣本的單細(xì)胞檢測，可以鑒定他們之間的遺傳差異，細(xì)胞類型組成和細(xì)胞階段差別，有利于追蹤轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞進化過程。結(jié)合克隆進化信息，有研究表明，多個克隆共遷移并建立了乳腺癌的浸潤性病變過程。

e. 定向治療的應(yīng)答 

 

治療應(yīng)答與微環(huán)境中的克隆選擇和細(xì)胞適應(yīng)相關(guān)，對惡性和非惡性細(xì)胞產(chǎn)生影響。傳統(tǒng)的組織測序很難發(fā)現(xiàn)內(nèi)在的組成，而單細(xì)胞測序則不同。對BRAF突變的黑素瘤單細(xì)胞測序，在治療前的樣本中鑒定到抗性相關(guān)的細(xì)胞特征。進一步的體外實驗表明，治療會使這個過程增強，這種情況可能不光是克隆選擇，可能也與藥物誘導(dǎo)的表觀修飾改變有關(guān)。在ER + / HER2−乳腺癌中，單細(xì)胞測序表明，經(jīng)過多療程治療后與原發(fā)性HER2 +乳腺癌相比，HER2表達增加，對靶向治療的敏感性降低。

 

單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展增進了我們對腫瘤異質(zhì)性，腫瘤進化，腫瘤微環(huán)境和治療反應(yīng)的理解。同時，隨著檢測通量的提高，更多稀有的，具有臨床意義的細(xì)胞亞群被發(fā)現(xiàn)。單細(xì)胞核RNA測序技術(shù)的出現(xiàn)為更多已經(jīng)保存的既有臨床樣本提供了可行檢測方案。單細(xì)胞甲基化，染色質(zhì)可及性檢測的出現(xiàn)豐富了探究細(xì)胞不同層面的深度�？臻g轉(zhuǎn)錄組的出現(xiàn)為更加深入了解腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞互作提供了可能。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展也為單細(xì)胞層面的蛋白和代謝產(chǎn)物檢測提供了支持。從現(xiàn)有階段來看，單細(xì)胞技術(shù)運用于腫瘤研究還處于早期階段，隨著研究的深入和技術(shù)的進一步發(fā)展，將為我們剖析腫瘤和治愈腫瘤提供更多新的見解。

 

 

L Nicolas Gonzalez Castro, Itay Tirosh, Mario L Suvà. Decoding Cancer Biology One Cell at a Time. Cancer Discov. 2021 Apr;11(4):960-970.