單細(xì)胞免疫組庫測序在免疫治療應(yīng)答機(jī)制研究中的應(yīng)用

免疫檢查點(diǎn)阻斷治療法目前已應(yīng)用于多種乳腺癌亞型的治療，但是患者的免疫應(yīng)答具有異質(zhì)性。這種決定治療效果異質(zhì)性的機(jī)制和標(biāo)志物的鑒定是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本研究中，研究者通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+TCR測序技術(shù)對接受抗PD1治療的乳腺癌患者治療前、中樣品進(jìn)行分析，探究治療前后腫瘤內(nèi)細(xì)胞表達(dá)特征的變化。

文章詳情

文章題目：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.

中文題目：乳腺癌患者抗PD1治療期間腫瘤內(nèi)變化的單細(xì)胞圖譜

發(fā)表時(shí)間：2021.5

期刊名稱：Nature Medicine

影響因子：36.131

實(shí)驗(yàn)平臺：10x Genomics Chromium（5‘表達(dá)文庫+TCR VDJ富集文庫）、CITE-seq

樣本類型和數(shù)量：

激素受體陽性或三陰性乳腺癌患者的治療前和治療中配對的活檢樣品，接受抗PD1治療患者（n=29）和新輔助化療后接受抗PD1治療患者（n=11）

DOI：10.1038/s41591-021-01323-8


研究背景

三陰性乳腺癌（TNBC）在乳腺癌（BC）患者占約15%，且其中具有大量腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs），說明免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）可能是針對TNBC的較好的治療方式。而新輔助化療期間加入抗PD１治療早期TNBC可增加病理完全緩解率和無事件生存率。此外，新輔助ICB療法還可用于BC其他亞型（ER^＋和HER２^-）。然而，并不是所有BC患者都能對新輔助ICB療法應(yīng)答，因此探究其中的原因和鑒定能決定治療效果的相關(guān)標(biāo)志物就成為亟待解決的問題。很多研究表明，T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增是ICB治療反應(yīng)的基礎(chǔ)，使用單細(xì)胞測序技術(shù)可獲得T細(xì)胞擴(kuò)增的模式和機(jī)制。然而，目前的研究都只著眼于容易獲得的樣品、較少的患者數(shù)或只專注于CD45⁺免疫細(xì)胞。因此，研究者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，單細(xì)胞TCR測序和CITE-seq方法對40例患者組織進(jìn)行測序，以達(dá)到鑒定BC患者ICB治療應(yīng)答機(jī)制的目的。


研究內(nèi)容

// 抗PD1治療前和治療中的單細(xì)胞圖譜分析

研究者所用的兩個(gè)研究隊(duì)列：１.未經(jīng)治療的非轉(zhuǎn)移性原發(fā)性乳腺浸潤癌患者在手術(shù)前大約９±２天接受pembrolizumab（Keytruda或抗PD1）治療；2.接受了為期20-24周的新輔助化療，隨后在手術(shù)前接受了pembrolizumab治療。在兩個(gè)隊(duì)列中，“治療前”樣品指在抗PD1治療前立即收集的活檢組織，“治療中”樣品指在手術(shù)中收集的，包含了不同的BC亞型患者。

針對隊(duì)列1的配對樣品使用單細(xì)胞免疫組庫測序（轉(zhuǎn)錄組+TCR），獲得了惡性乳腺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。其中，惡性乳腺上皮細(xì)胞拷貝數(shù)不穩(wěn)定，且在患者中的分布具有特異性，治療前、中的組織或不同BC亞型之間沒有聚類偏倚。TCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)9名患者的配對樣品均發(fā)生克隆性擴(kuò)增，研究者命名其為“E（s）”，其他20名命名為“NE（s）”。治療過程中一些克隆型消失了，說明T細(xì)胞發(fā)生了克隆型收縮，不過克隆型收縮沒有克隆型擴(kuò)增明顯，且在Es和NEs中平均分布。值得注意的是，有些NE（n=11）治療前T細(xì)胞比例較高，但在抗PD1治療后不能擴(kuò)增。其余的NEs 的T細(xì)胞頻率較低而且也不能擴(kuò)增。此外，治療中樣品里61%的擴(kuò)增T細(xì)胞的克隆型在治療前就已存在。
 

Fig 1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、細(xì)胞注釋和T細(xì)胞表現(xiàn)型

 

// 表達(dá)PD1的T細(xì)胞在抗PD1治療后增殖

接下來，研究者根據(jù)不同分組比較單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。治療前，成纖維細(xì)胞多見于NEs中，T細(xì)胞則多見于Es中。治療中，癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在NEs中更多見，T細(xì)胞在Es中進(jìn)一步富集。對T細(xì)胞做亞亞群分析鑒定到表達(dá)PD1的CD8⁺和 CD4⁺細(xì)胞群（具有耗竭樣特征的活化T細(xì)胞），并命名為TEX cells。研究者還鑒定到一個(gè)高度增殖的T細(xì)胞組成的PD1⁺細(xì)胞群，在治療前、中相對豐度高，且在治療過程中增加。在治療中，擴(kuò)增T細(xì)胞主要由CD4⁺和CD8⁺TEX 細(xì)胞組成，但也有一部分CD8⁺效應(yīng)/記憶細(xì)胞。Es與NEs相比，治療前、中樣品的T細(xì)胞克隆性和Gini指數(shù)增加，TEX cells克隆性最強(qiáng)，而克隆型豐度則恰好相反。此外，通過CITE-seq證實(shí)Es治療前T細(xì)胞的PD1蛋白表達(dá)增加�？傊�，PD1⁺T cells的比例與T細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)，CD8⁺和CD4⁺TEX 細(xì)胞是抗PD1治療后主要的擴(kuò)增T細(xì)胞。

// 沿CD８^＋TEX或CD4^＋TH1、TFH細(xì)胞軌跡的T細(xì)胞擴(kuò)增治療后增殖

研究者構(gòu)建了CD8⁺T細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡。T_N細(xì)胞是軌跡的起點(diǎn)，連接T_EM細(xì)胞，隨后出現(xiàn)三條分支：T_EX1和T_EX2、T_RM、T_EMRA。Es與NEs相比，無論是治療前和治療中，TEX細(xì)胞更多見于軌跡的末端。Es治療中的T_EX細(xì)胞具有更多的“顯著效應(yīng)活性”和“短暫/早期耗竭”特征。此外，在所有軌跡中，Es比NEs具有更少的TCR豐度，與治療前相比，治療中的TCR豐度減少更明顯，說明抗PD1誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增。擴(kuò)增的TEX細(xì)胞在軌跡末尾處富集，尤其是治療過程中。

在CD4⁺T細(xì)胞軌跡中，T_EX細(xì)胞分裂成T_H1和T_FH細(xì)胞。軌跡從T_N1出發(fā)，向T_N2移動(dòng)，隨后是T_EM1-3，然后分裂成T_H1或T_FH細(xì)胞。NEs中的這2類細(xì)胞治療前和治療中都保持早期的前效/記憶狀態(tài)，而Es治療中，T細(xì)胞活性和早期耗竭標(biāo)志物表達(dá)增加。TCR豐度在接近軌跡末端時(shí)下降，尤其是在Es的T_H1細(xì)胞里。而在Es治療中，增殖在接近末端時(shí)增加。當(dāng)沿著軌跡比較擴(kuò)增和非擴(kuò)增的CD4⁺T細(xì)胞時(shí)，T_H1和T_FH細(xì)胞在軌跡末期富集，尤其是Es治療中�？傮w而言，T_H1和T_FH細(xì)胞對克隆型擴(kuò)增有重要貢獻(xiàn)，表明它們支持CD8⁺ TEX細(xì)胞正在進(jìn)行的效應(yīng)功能。另外，沿著CD8⁺TEX細(xì)胞或CD4⁺T_H1細(xì)胞軌跡分析基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了Es和NEs中表達(dá)或激活的差異基因和信號通路。

Fig 2. CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞軌跡分析

//  T細(xì)胞表達(dá)特征預(yù)測T細(xì)胞擴(kuò)增

將治療前擴(kuò)增和非擴(kuò)增T細(xì)胞比較篩選差異基因并結(jié)合GSEA分析發(fā)現(xiàn)，非擴(kuò)增T細(xì)胞更加naive，而擴(kuò)增T細(xì)胞則具有效應(yīng)功能、免疫細(xì)胞歸巢、細(xì)胞毒性、抗原提呈特性，同時(shí)也主要表達(dá)免疫檢查和腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞marker基因�？寺⌒蛿U(kuò)增的數(shù)量也與這些基因及其相關(guān)通路有關(guān)。治療前Es與NEs相比，免疫檢查標(biāo)志物和CD4⁺T_H1活性預(yù)測T細(xì)胞擴(kuò)增效果最好。CITE-seq結(jié)果證實(shí)NEs中的naive T細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)更高，而免疫檢查點(diǎn)、腫瘤反應(yīng)性和共刺激標(biāo)志物表達(dá)更低。將TNBC Es（n=5）與ER+BC（n=3）比較發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的克隆型數(shù)量沒有差異，但TNBC中，治療前T細(xì)胞的PD1表達(dá)和增殖T細(xì)胞數(shù)量更高。與ER+Es比較，TNBC中擴(kuò)增性CD8⁺T細(xì)胞效應(yīng)功能上調(diào)，而其中的CD4⁺T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)抗原提呈基因。相反地，ER+Es的擴(kuò)增性CD8⁺、CD4⁺T細(xì)胞過表達(dá)naive和前效相關(guān)標(biāo)志物，說明與TNBC相比雖然T細(xì)胞擴(kuò)增程度相似，但分化程度較低。
 

Fig 3. BC和BC亞型中的擴(kuò)增性與非擴(kuò)增性T細(xì)胞比較

// 新輔助化療和抗PD1治療后的T細(xì)胞擴(kuò)增

研究者使用相同研究策略分析隊(duì)列２的治療前和治療中樣品，得到了3名Es。在Es中，T細(xì)胞和pDCs增多，在治療前、中樣品，PD1表達(dá)和CD4⁺及CD8⁺TEX細(xì)胞均增多。比較治療前擴(kuò)增和非擴(kuò)增T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了與只接受抗PD1的患者相似的差異基因或信號通路。T_H1活性和其中的50個(gè)特征差異基因可有效預(yù)測T細(xì)胞擴(kuò)增，證明當(dāng)新輔助化療與抗PD1結(jié)合時(shí)，CD4⁺T_H1細(xì)胞也參與T細(xì)胞擴(kuò)增。

// 樹突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)系

將隊(duì)列1患者得到的DC再分群獲得了6個(gè)DC亞群。與NEs相比，Es的PD-L1和PD-L2表達(dá)量增加，在DC中，PD-L1只在mregDC亞群表達(dá)。Es治療前的mregDC相對頻率較高，而其他類型DC的相對頻率在Es與NEs的治療前樣品中并無太大差異。pDC、ASDC和mregDC在Es治療中數(shù)量更多。此外，研究者還篩選了Es與NEs治療前、中的差異基因涉及的功能及通路�？傊�，DC在ES中，無論治療前還是治療中，都具有免疫應(yīng)答功能且支持T細(xì)胞功能。

與DC類似，巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1和PD-L2，在治療前，這兩個(gè)基因、幾個(gè)細(xì)胞因子（CXCL9等）和I/II型干擾素應(yīng)答基因在ES中的上調(diào)表達(dá)，而CX3CR1和C3下調(diào)表達(dá)。
 

Fig 4. 表達(dá)PD-L1的樹突細(xì)胞與巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)系

// T細(xì)胞擴(kuò)增的腫瘤中，癌細(xì)胞受抗PD1治療影響

在Es中，癌細(xì)胞數(shù)量隨治療變少。盡管在癌細(xì)胞中未能檢測到PD-L1的表達(dá)，但大量抗原提呈MHC I/II型基因在NEs中下調(diào)表達(dá)，與NEs相比，抗原加工及提呈和IFN-γ 應(yīng)答信號通路在Es中上調(diào)表達(dá)。將Es治療前、中相比較發(fā)現(xiàn)，治療中的癌細(xì)胞具有一種持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)，且富集細(xì)胞增殖、蛋白水解、細(xì)胞死亡、免疫信號和細(xì)胞毒性通路。最后，研究者分析了各類細(xì)胞的相對頻率與T細(xì)胞擴(kuò)增的相關(guān)性，并使用CellphoneDB分析配體受體互作關(guān)系，確認(rèn)了不同樣品細(xì)胞內(nèi)的共刺激與共抑制作用。

主要結(jié)論

本研究對象為在手術(shù)前進(jìn)行抗PD1治療的激素受體陽性或三重陰性（TNBC）的乳腺癌（BC）患者，針對只接受抗PD１治療的患者（29例）或先接受新輔助化療后再接受抗PD1治療的患者（11例）的活檢組織（治療前和治療中的配對組織），進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、TCR和蛋白組分析。主要結(jié)論如下：

1. 三分之一腫瘤包含表達(dá)PD1的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞在抗PD1治療后發(fā)生克隆性擴(kuò)增，而與腫瘤亞型無關(guān)。擴(kuò)增主要涉及CD8⁺T細(xì)胞（顯著表達(dá)細(xì)胞毒性、免疫細(xì)胞歸巢和耗竭標(biāo)志物）和CD4⁺T細(xì)胞（表達(dá)T-helper-1和follicular-helper標(biāo)志物）。

2. 在治療前活檢組織中，免疫調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（PD-L1⁺）、特異性巨噬細(xì)胞表型（CCR2⁺、MMP9⁺）和主要組織相容性復(fù)合體I/II類表達(dá)的癌細(xì)胞的相對頻率與T細(xì)胞擴(kuò)增呈正相關(guān)。

3. 未分化的前效/記憶T細(xì)胞（Tcf7⁺、GZMK⁺）或抑制性巨噬細(xì)胞（CX3CR1⁺、C3⁺）與T細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。

這些數(shù)據(jù)分析結(jié)果確定了各種免疫表型和相關(guān)基因集，它們與抗PD１治療后T細(xì)胞擴(kuò)增呈正、負(fù)相關(guān)，并闡明乳腺癌患者抗PD1治療響應(yīng)的異質(zhì)性特征。

參考文獻(xiàn)
Bassez, Ayse et al. “A single-cell map ofintratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.”Nature medicine vol. 27,5 (2021): 820-832.