條件性敲除小鼠的原理、構(gòu)建與應(yīng)用

什么是Cre-Lox系統(tǒng)
Cre-Lox基因重組系統(tǒng)是一種被廣泛應(yīng)用于特異性基因敲除、基因易位、基因翻轉(zhuǎn)以及基因插入等操作的基因重組手段。

Cre重組酶（cyclization recombination enzyme）最早于1981年在P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，該酶由343個氨基酸組成，除了擁有催化活性外，同時還可以識別特定序列：Loxp位點，該位點同樣在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，序列長度為34bp[1]。當目的基因序列兩端插入相同方向的Loxp位點，同時有Cre重組酶存在時，Cre重組酶可將兩個Loxp位點之間的DNA序列剪除并重新將兩端環(huán)化連接，達到特異性基因敲除的目的，如圖1b所示[2]。而當目的基因序列兩端插入方向相反的Loxp序列時，Cre可導(dǎo)致Loxp之間的序列發(fā)生反轉(zhuǎn)，如圖1c所示[2]。
 

圖1. Cre-Lox基因重組系統(tǒng)工作原理[2]

利用Cre-Lox系統(tǒng)如何制備條件性敲除小鼠
Cre-Lox系統(tǒng)的優(yōu)勢在于可以利用組織特異性啟動子特異性控制Cre在特定組織的表達，以實現(xiàn)在特定組織細胞中對目的基因的敲除或改造，更好的規(guī)避全身敲除小鼠的胚胎致死現(xiàn)象。

1. Cre鼠的類型及應(yīng)用
為了更好的控制Cre重組酶的表達時間，通過使用具有雌激素受體的突變配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Cre融合蛋白（Cre-ERT），可以實現(xiàn)對Cre活性的時間控制，該蛋白可以通過他莫昔芬誘導(dǎo)而被激活[1]。在無他莫昔芬誘導(dǎo)時，Cre-ERT融合蛋白與熱激蛋白Hsp90結(jié)合，定位于細胞質(zhì)中；當他莫昔芬給藥誘導(dǎo)時，Hsp90脫離Cre-ERT融合蛋白，使Cre-ERT融合蛋白暴露核定位信號進入細胞核，發(fā)揮基因重組的作用[3]。這一融合蛋白的介入相當于為Cre-Lox系統(tǒng)加裝了一個由他莫昔芬控制的外源開關(guān)，使得體內(nèi)基因編輯更具時空靈活性。為了提升該系統(tǒng)的靈敏性、特異性，ER配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域被進一步突變?yōu)镃re-ERT2，該系統(tǒng)對他莫昔芬代謝活性物質(zhì)4-羥基他莫昔芬（TAM主要通過肝臟的細胞色素P450酶代謝為活性產(chǎn)物4-OH-TAM）的敏感性提升了10倍[4]。同樣的，Cre-ERT2并非完美無暇，Poorva Sandlesh等人研究發(fā)現(xiàn)CreERT2-Lox系統(tǒng)在敲除SSRP1的應(yīng)用中，存在效率過低問題[5]。

Cre鼠常用于與Flox小鼠雜交進行條件性的目的基因敲除，但也有研究將Cre鼠用于切割位于報告基因前的終止序列，以達到熒光標記特定細胞的目的，進一步研究細胞命運。

2. Flox鼠與Cre鼠的配繁
在實際應(yīng)用中，通過不同的Flox鼠與Cre鼠的配繁可以實現(xiàn)多種研究目的，通過組織/細胞特異性Cre鼠敲除特定組織/細胞群體的特定基因是最為常見的一種。

F0代與野生鼠互配獲得F1代雜合子，F(xiàn)1代雜合子（flox/+）互配得到F2代純合子（flox/flox），F(xiàn)2代純合子（flox/flox）與全身/組織特異性工具鼠交配獲得F3代（flox/+, Cre），F(xiàn)3代（flox/+, Cre）互配得到F4代（flox/flox, Cre），即cKO/cKI純合子。
 

圖2. 條件性敲除（敲入）鼠建系流程

CAUTION！
（1）如果是通過打靶構(gòu)建的全身/組織特異性工具鼠，要注意選擇與目的基因不在同一條染色體上，以免繁殖不到cKO/cKI純合子。

（2）有生殖細胞泄露風險的Cre工具鼠，繁殖時按照建議性別選擇不同基因型鼠。

（3）誘導(dǎo)型的Cre工具鼠，需要加藥后才能實現(xiàn)特異組織刪除。

（4）F1代若有剩余的flox雜合鼠（flox/+），或想要加快獲得目標鼠，第2步可以用flox/+直接配Cre工具鼠，可縮短一代周期。

（5）即使是組織特異性工具鼠，也可能在其他組織有泄露表達的風險。

條件性敲除小鼠的應(yīng)用
在科研中，條件性敲除小鼠的應(yīng)用對探究基因或蛋白在體內(nèi)作用及分子機制有著重要意義。下文以賽業(yè)生物客戶發(fā)表在《Nature Communications》雜志上的一篇題為Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis的文章為例，對條件性基因敲除小鼠的應(yīng)用加以說明。

之前的研究認為HPIP蛋白主要在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用，該文為了研究HPIP在骨關(guān)節(jié)炎中的作用，分析了118對骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織及相應(yīng)非病變樣本中HPIP的表達水平。結(jié)果顯示，骨關(guān)節(jié)炎軟骨中HPIP的表達明顯高于非病變組織。而且，HPIP的表達隨著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展而逐漸增加，而細胞外基質(zhì)（ECM）組分COL2A1和ACAN的表達逐漸減少，表明它可能參與關(guān)節(jié)軟骨退化中的ECM降解。

研究者通過將Col2a1-CreERT2基因型小鼠與HPIP flox/flox小鼠雜交兩代后獲得Col2a1-CreERT2; HPIP flox/flox小鼠，即誘導(dǎo)后可以在在ECM中敲除HPIP基因的基因工程小鼠模型，染色結(jié)果表明，與對照組小鼠相比，敲除組小鼠表現(xiàn)出明顯的骨骼異常，敲除組小鼠肱骨、股骨、脛骨和椎骨等骨骼的長度比對照小鼠短10-21%。隨后研究人員分別將兩組小鼠膝關(guān)節(jié)中的前十字韌帶切除，并檢查手術(shù)后的軟骨厚度和覆蓋面積。結(jié)果顯示在手術(shù)后4周和8周時，對照組小鼠的軟骨厚度和覆蓋面積都低于條件性敲除組小鼠。一系列結(jié)果均指出，HPIP基因的條件性敲除可以防止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。該文章對于基因工程小鼠的應(yīng)用有效的彌補了臨床樣本的病程中相關(guān)數(shù)據(jù)，與臨床樣本聯(lián)合揭示了HPIP在骨關(guān)節(jié)炎中的作用。

圖3. HPIP的敲除可以防止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[6]

參考文獻：

[1] Nagy, A., Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis, 2000. 26(2): p. 99-109.

[2] Friedel R.H., et al., Generating Conditional Knockout Mice. Transgenic Mouse Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, 2011. 693.

[3] Zhang, J., et al., Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era. J Zhejiang Univ Sci B, 2012. 13(7): p. 511-24.

[4] Indra, A.K., et al., Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ER(T) and Cre-ER(T2) recombinases. Nucleic Acids Res, 1999. 27(22): p. 4324-7.

[5] Sandlesh, P., et al., Uncovering the fine print of the CreERT2-LoxP system while generating a conditional knockout mouse model of Ssrp1 gene. PLoS One, 2018. 13(6): p. e0199785.

[6] Ji Q., et al., Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Commun. 2019 18;10(1): p. 313.

本文來自賽業(yè)生物(www.cyagen.com)