活體光透明技術(shù)在活體神經(jīng)血管成像中的應(yīng)用

       光透明技術(shù)是利用化學(xué)或物理的原理與方法將大塊組織或完整器官甚至活體動(dòng)物透明化處理的技術(shù)，通過(guò)光學(xué)儀器直接對(duì)組織或器官內(nèi)的細(xì)胞等結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和研究。近年來(lái)，組織光透明技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)機(jī)械切片顯微成像技術(shù)的不足，作為新興起來(lái)的一種生物組織學(xué)技術(shù)，受到了越來(lái)越多科研人員的關(guān)注與青睞。

       最早見(jiàn)諸報(bào)道的組織光透明技術(shù)是德國(guó)科學(xué)家Werner Spalteholz用苯甲醇和水楊酸甲酯混合物“清除”心臟等大型器官。而最早嘗試腦組織光透明的方法，可以追溯到2007年維也納科技大學(xué)和德國(guó)馬普研究所的研究者首次使用苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物（BABB）透明小鼠全腦，并繪制出3D小鼠腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在此之后組織光透明技術(shù)迅猛發(fā)展，到如今已經(jīng)有幾十種組織光透明相關(guān)技術(shù)。
       由于研究的需要，許多時(shí)候需要在研究生物體存活時(shí)觀察并監(jiān)測(cè)體內(nèi)活動(dòng)，如在活體動(dòng)物觀察腦血管或腦神經(jīng)。目前腦血管或腦神經(jīng)的在體觀察主要通過(guò)光學(xué)顯微鏡，此類(lèi)光學(xué)儀器在要求分辨率的情況下無(wú)法實(shí)現(xiàn)較深層成像，其成像對(duì)比度和深度都受到限制。因此將光透明技術(shù)引入到活體組織觀察腦血管或腦神經(jīng)，在解決成像對(duì)比度和深度這兩大關(guān)鍵問(wèn)題方面具極大潛力。武漢光電國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們將活體光透明技術(shù)引入到激光血流成像和雙光子顯微成像的相關(guān)研究課題中，根據(jù)長(zhǎng)期對(duì)該技術(shù)的研究和發(fā)展形成了活體顱骨光透明技術(shù)、活體皮膚光透明技術(shù)和活體硬組織光透明技術(shù)等活體光透明系列技術(shù)。
       激光散斑血流成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)直觀地觀察皮下血管結(jié)構(gòu)并評(píng)估其功能，不僅是了解正常的活體器官生理，而且對(duì)觀察各類(lèi)疾病中微血管功能障礙進(jìn)展與神經(jīng)退行性變之間的關(guān)系也至關(guān)重要。其原理為觀察目標(biāo)受到激光束照射時(shí)，反射后的激光形成隨機(jī)干擾圖像（包括亮區(qū)和暗區(qū)），該圖像稱(chēng)為激光散斑圖。如果被測(cè)目標(biāo)靜止，激光散斑圖也保持不變；如果被測(cè)物體發(fā)生移動(dòng)，例如組織中的紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，則激光散斑圖會(huì)隨之波動(dòng)。散斑變化速度以散斑對(duì)比度量化，而對(duì)比度與血流相關(guān)；這就是激光散斑血流成像技術(shù)用于血流流速變化和灌注量評(píng)估的工作原理。        就像所有的光學(xué)成像技術(shù)一樣，激光散斑血流成像技術(shù)也受限于成像深度，對(duì)皮膚表面的血管和血流能夠成像，再深層就很難進(jìn)行觀察。引入活體光透明系列技術(shù)，不但可以提升激光散斑血流成像深度，而且提升了分辨率，以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活體光透明后激光散斑血流成像的結(jié)果更清晰，背景更為“清澈”。         在很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都需要開(kāi)顱手術(shù)以進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，活體顱骨光透明后無(wú)需開(kāi)顱即可進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。目前完整顱骨是觀察小鼠大腦皮下神經(jīng)和血管的主要障礙，為了克服這一障礙，科研工作者們開(kāi)發(fā)出幾種類(lèi)型的顱窗，包括磨薄顱窗、開(kāi)顱手術(shù)和磨薄加固顱窗等。這些顱窗在某些情況下滿(mǎn)足研究要求，但有局限性。例如，在顱骨窗變薄的情況下，很難進(jìn)行大面積重復(fù)成像；開(kāi)顱手術(shù)幾乎不可避免地會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)損傷和炎癥；至于磨薄加固顱窗操作復(fù)雜且也會(huì)造成損傷。而活體組織光透明的應(yīng)用解決了這些問(wèn)題。通過(guò)在顱骨上進(jìn)行組織光透明，可直接觀測(cè)小鼠大腦皮下血管，不用對(duì)顱骨造成損傷。        如同激光散斑成像碰到“小鼠顱骨”的問(wèn)題一樣，在皮質(zhì)上小鼠顱骨也阻礙了熒光標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和微血管的觀察。同樣，活體顱骨光透明技術(shù)也能輔助雙光子顯微鏡進(jìn)行更深層成像，無(wú)需顱窗手術(shù)“越過(guò)”顱骨成像觀察。       根據(jù)以上結(jié)果可以明顯發(fā)現(xiàn)，活體光透明處理后雙光子成像的信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。Z軸平均信號(hào)強(qiáng)度圖表明，成像深度也大大提高。隨機(jī)選擇了幾個(gè)微血管(n=6)，計(jì)算它們的直徑，以確定透明處理前后的最小可分辨血管直徑。透明處理前成像深度約為120μm，僅能檢測(cè)到少量血管(6 7.5±7.9μm)。光學(xué)透明顱骨窗后，成像深度增加到約300μm，大血管和微血管均可分辨(4.5±0.3 1μm)。這些結(jié)果表明，光透明處理顱骨不僅提高了雙光子顯微鏡的成像分辨率和對(duì)比度，而且還大幅提升了成像深度。          活體顱骨光透明技術(shù)是一種無(wú)損非侵入的顱窗透明方法，能夠大幅度提升成像深度、透明后成像背景“清澈“從而提高成像質(zhì)量，透明的速度極快（僅需15分鐘即可完成），最主要的特點(diǎn)：移除光透明劑后顱骨可再生，可進(jìn)行多次重復(fù)成像。
       活體光透明技術(shù)作為一種新興的活體成像樣本制備技術(shù)，具有革命性的意義。在維持活體器官活性和完整性的同時(shí)具有光透明特征，不但廣泛應(yīng)用于活體激光血流成像的相關(guān)研究，在雙光子觀察神經(jīng)元和血管的應(yīng)用方面也具有廣闊前景。  
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