單細胞技術(shù)在癌癥免疫治療中的應(yīng)用

單細胞技術(shù)正逐步成為癌癥研究的強大工具。通過單細胞技術(shù)檢測，能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)，特別是免疫治療后每個細胞的分子狀態(tài)，為理解腫瘤異質(zhì)性、微環(huán)境細胞類型組成和細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變提供了可能。對于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)來說，分析臨床樣本非常重要，但在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)。近日，《Nature Cancer》發(fā)表了一篇名為“From bench to bedside: single-cell analysis for cancer immunotherapy”的文章，具體描述了包括空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)學(xué)在內(nèi)的單細胞技術(shù)從樣本收集到數(shù)據(jù)分析的方法步驟，及其在癌癥治療研究中的應(yīng)用。


現(xiàn)有的，最常見的可用于腫瘤免疫治療研究的單細胞技術(shù)包括用于轉(zhuǎn)錄分析的單細胞RNA測序（scRNA-seq）、用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的質(zhì)譜流式細胞術(shù)（CyTOF）和空間檢測技術(shù)。這些技術(shù)提供了細胞的分子圖譜，將細胞分為不同的細胞群，實現(xiàn)細胞類型注釋，推測細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換以及關(guān)聯(lián)的分子通路。以此，我們可以確定驅(qū)動每種不同細胞類型行為的途徑，并推斷與細胞狀態(tài)變化相關(guān)的細胞內(nèi)和細胞間相互作用。這些途徑的推論被廣泛用于當(dāng)前腫瘤免疫學(xué)的臨床研究。目前正在開發(fā)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)策略是通過聯(lián)合療法重塑TME以提高免疫治療敏感性。這個過程中，單細胞方法有望助力精準(zhǔn)免疫治療。

目前可用于了解腫瘤的細胞組成和細胞間相互作用的幾種方法包括：
1、 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué) (CyTOF) 提供細胞組成和細胞狀態(tài)信息。

2、單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)可提供與（A）相同的分析，也可以提供細胞軌跡預(yù)測以及T細胞和B細胞免疫組庫信息�？臻g技術(shù)能將細胞組成、狀態(tài)、細胞相互作用相關(guān)聯(lián)。

3、借助空間蛋白質(zhì)組學(xué)及其單細胞分辨率，可以識別單個細胞類型并確定特定的細胞間相互作用。

4、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)雖然缺乏單細胞分辨率，但可以根據(jù)不同臨近細胞之間受體和配體的分子表達預(yù)測細胞相互作用，并發(fā)現(xiàn)不同細胞壁龕之間的致癌途徑。

圖1：癌癥分析的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法

樣本制備

大多數(shù)非空間單細胞技術(shù)，如scRNA-seq和CyTOF，需要解離并獲得活細胞進行分析（圖1A和1B）。最常用的樣品分離方法是酶消化。分離前的樣品儲存、酶的類型和孵育時間都會影響單細胞分析結(jié)果，因此必須針對每種腫瘤類型仔細優(yōu)化。而空間檢測技術(shù)是基于玻片開發(fā)的技術(shù)，該技術(shù)保留了組織結(jié)構(gòu)，無需進行解離。空間蛋白質(zhì)組可以對冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品進行檢測（圖1C）。當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組測序方法依賴于冷凍樣本，使用FFPE樣本的方法正在開發(fā)中（圖1D，目前10X Genomics公司剛剛推出針對FFPE樣品的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)）。對FFPE保存樣品進行檢測使得對處理后并長期儲存的樣品進行回顧性臨床研究成為了可能。

數(shù)據(jù)分析

1、高通量單細胞或者空間組學(xué)數(shù)據(jù)分析的常規(guī)流程如下：

2、 單細胞和空間數(shù)據(jù)分析將從原始數(shù)據(jù)預(yù)處理開始，以去除質(zhì)量差的細胞和數(shù)據(jù)；批量校正以消除由于實驗差異導(dǎo)致的樣品間誤差；數(shù)據(jù)填充以糾正實際數(shù)據(jù)缺失。

3、降維并使用聚類工具進行數(shù)據(jù)可視化和細胞類型注釋，這些工具根據(jù)每個細胞群表達的特定marker進行注釋。從這里開始，數(shù)據(jù)準(zhǔn)備好進行下游分析，具體取決于應(yīng)用的方法和生物學(xué)問題。

4、可以使用差異表達分析來識別分子改變。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，還可以進行通路分析以確定癌癥進展的驅(qū)動因素和對治療的反應(yīng)，以及預(yù)測細胞命運軌跡以了解腫瘤和 TME隨時間的調(diào)節(jié)。

6、最后，通過多組學(xué)方法對相同樣本的蛋白質(zhì)和基因表達分析 或T細胞和B細胞免疫組庫分析與轉(zhuǎn)錄分析相結(jié)合，可增加細胞類型注釋的準(zhǔn)確性并研究它們在癌癥演變和治療反應(yīng)中的作用。

圖2：單細胞和空間分析的數(shù)據(jù)分析流程和方法

患者腫瘤之間的異質(zhì)性以及無法在患者中測試多種治療方案進一步挑戰(zhàn)了轉(zhuǎn)化研究中的單細胞機制研究。匯集臨床試驗研究和來自臨床前模型的干擾研究的單細胞圖譜可以為這類研究提供重要參考。用免疫療法治療的臨床前模型的單細胞分析可以發(fā)現(xiàn)與治療反應(yīng)相關(guān)的細胞類型和通路，而對用相同療法治療的樣本進行跨物種分析可以揭示哪些治療反應(yīng)是保守的。從單細胞數(shù)據(jù)集中比較小鼠和人類保守反應(yīng)的新分析工具可以進一步支持臨床前分析的模型選擇，為臨床試驗的設(shè)計提供信息。

圖3：從小鼠到人體的高維分析研究將推動下一代精準(zhǔn)癌癥免疫療法

參考文獻來源：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.07.004