單細胞轉錄組技術構建肝細胞癌的免疫抑制譜

人肝細胞癌是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，也是全球范圍最常見的惡性腫瘤之一。遺傳、表觀遺傳改變和病毒感染是肝癌的主要誘發(fā)因素。由于復發(fā)和轉移率高，肝細胞癌的死亡率較高。為了研究人肝細胞癌的免疫抑制機制，本文作者使用單細胞轉錄組測序技術，分析細胞間相互作用，剖析腫瘤的細胞異質性。

文章詳情 

文章題目：Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma.

中文題目：單細胞轉錄組揭示HBV相關肝細胞癌的免疫抑制譜和腫瘤異質性

發(fā)表時間：2021.06

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：14.911

實驗平臺：10x Genomics Chromium scRNA-seq

DOI：10.1038/s41467-021-24010-1

研究背景

人肝細胞癌（HCC）由復雜的腫瘤微環(huán)境 (TME) 組成，由細胞（腫瘤浸潤免疫細胞和基質細胞）、化學成分（趨化因子）和物理成分（細胞外基質）組成。這些相互作用以支持 HCC 的發(fā)展并影響治療反應。對HCC的傳統(tǒng)研究主要針對大塊腫瘤組織，缺少TME中單個細胞的精確信息，而單細胞測序則成為研究癌癥的重要平臺。關于HCC，使用單細胞測序研究的案例還很少，而且這些案例在揭示整體多方面狀態(tài)和交互作用方面存在限制性。研究者近期對源自患者的HCC腫瘤異種抑制模型進行研究，確定了與干細胞相關的腫瘤細胞亞群。由于該模型的免疫受損背景和非人類物種的限制，本文對一組乙型肝炎病毒（HBV）相關的HCC臨床樣品進行單細胞轉錄組研究，從而更好的概括人HCC中實際發(fā)生的生物學過程。

研究內容
// HBV相關的HCC患者的單細胞轉錄組圖譜  

研究者對8個人HCC患者的腫瘤組織解離并分選去除死細胞，隨后進行單細胞轉錄組測序獲得了34個細胞亞群。結果表明，惡性細胞與非惡性細胞聚集成不同的細胞亞群，來自不同病例的惡性細胞（腫瘤細胞）分布在不同的細胞簇中，而來自多個病例的非惡性細胞聚集在一起，說明腫瘤間異質性水平相對較高。計算細胞比例發(fā)現(xiàn)T細胞和巨噬細胞比例可能有負相關關系，并利用bulk-RNA測序結果和TCGA數(shù)據庫進行驗證，說明腫瘤相關巨噬細胞（TAM）的豐度可能用于預測腫瘤浸潤性T細胞是否稀缺。

Fig.1 單細胞轉錄組揭示TAM和CD8⁺T細胞之間呈負相關關系

// TAMs免疫抑制標志物表達及預后意義   

TAMs中，LAIR1、HAVCR2（也稱為 TIM3）、LGALS9 和 VSIR 富集表達，特異性強。研究者發(fā)現(xiàn)在不同細胞群中CD163（M2 巨噬細胞 marker）和LAIR1的富集模式最相似，結合TCGA數(shù)據庫中的RNA-seq數(shù)據集檢測到這兩個基因的表達顯著相關，因此研究者猜測TAM 的免疫抑制功能可能是通過 LAIR1 發(fā)揮的，LAIR1 在 M2 巨噬細胞中具有免疫抑制作用。生存分析表明這兩個基因的高表達均與HCC患者較差的生存期顯著相關，免疫熒光染色也能頻繁觀察到LAIR1和M2巨噬細胞重疊，LAIR1和CD163經常共表達。這些結果都支持M2 巨噬細胞中 LAIR1 富集表達的假設。

// 不同的腫瘤浸潤免疫細胞亞群軌跡分析   

為了確定TME中細胞狀態(tài)的演變關系，研究者進行了多種腫瘤浸潤免疫細胞的擬時間序列分析，包括CD8⁺T、CD4⁺T、Treg、NK和TAM。CD8⁺T 和NK細胞逐漸過渡到具有衰竭狀態(tài)的亞群狀態(tài)，Treg細胞向更具免疫抑制狀態(tài)的方向改變，TAM則向更具有免疫異質性的M2巨噬細胞狀態(tài)改變，CD4⁺T主要是Th1和Th2細胞類型。這些結果表明免疫細胞向更具耗竭性或免疫抑制性狀態(tài)轉變，并描繪了HCC腫瘤中的整體免疫抑制性細胞圖譜。

Fig.2 主要免疫細胞類型的擬時間序列分析

// 免疫檢查點的免疫抑制譜   

研究者接下來確認了免疫檢查點成分在腫瘤浸潤免疫細胞和互補抗原呈遞細胞（APC）中的表達情況。利用細胞間互作分析（如：T細胞和腫瘤細胞），評估不同共刺激和共抑制檢查點在塑造HCC免疫抑制譜中的相對貢獻。通過 TIGIT-NECTIN2 確定了一個突出的共抑制信號，而NECTIN2（PVRL2）是 PVR 基因家族中表達最高的基因。在研究者內部隊列和TCGA隊列中，與相應的非腫瘤肝臟相比，HCC 中的 NECTIN2 顯著上調。此外，對一組HCC和一組與HCC或HBV無關的肝硬化患者進行IHC檢測TIGIT 和 NECTIN2 表達。結果表明，這兩個蛋白在HCC中表達顯著相關，而與HCC或HBV無關肝硬化組中則沒有相關性，這說明TIGIT-NECTIN2 軸可能是一種腫瘤逃避策略，而不是病毒逃避策略。與非腫瘤相比，腫瘤中NECTIN2表達顯著上調， 說明NECTIN2過表達可能對構建 HCC 發(fā)展中的免疫抑制譜很重要。研究者還在Treg 細胞中檢測到多種免疫抑制免疫檢查點基因的大量表達。此外，雖然PD-1 (PDCD1) 和 PD-L1/L2 (CD274/PDCD1LG2) 之間的相互作用很小，但在 Treg 細胞和巨噬細胞中CTLA4-CD86 和 HAVCR2-LGALS9 軸的共抑制信號很大。

Fig.3 HCC免疫檢查點分析揭示TIGIT-NECTIN2 相互作用重要性

與 PVR/NECTIN2 連接后，TIGIT 充當 T 和 NK 細胞的抑制性受體。為了研究在 HCC 細胞上表達的 NECTIN2 是否會導致 T 細胞耗竭，研究者在小鼠HCC細胞系Hepa1-6中用Crisper-Cas9敲除系統(tǒng)構建了Nectin2穩(wěn)定敲除 (KO) 細胞。將Hepa1-6和小鼠脾臟T細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與獨自培養(yǎng)的T細胞相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)中小鼠 HCC 細胞的存在顯著抑制了 CD4⁺或 CD8⁺T細胞的增殖，而Anti-Nectin2抗體在共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著恢復 CD4⁺和 CD8⁺T細胞增殖能力。Nectin2敲除實驗也證明該基因抑制了T細胞增殖。接下來，研究者在Tp53敲除和c-Myc過表達HCC小鼠構建了Nectin2敲除模型，發(fā)現(xiàn)敲除鼠的HCC腫瘤變小，多種T細胞免疫浸潤增強，IHC結果檢測到敲除模型中T細胞增加也進一步證實上述結果，且這些T細胞中的耗竭標志物表達量沒有顯著改變。這些結果證明NECTIN2可限制 HCC 中 T 細胞浸潤和活性的功能。

// HCC 腫瘤細胞的亞克隆異質性和譜系層次   

研究者根據整體轉錄組學特征對HCC腫瘤細胞進行分層，并發(fā)現(xiàn)HCC腫瘤細胞主要按照不同病例分層聚類，說明個體間異質性比個體內更強。接下來，根據一組LCSC marker基因表達模式進行無監(jiān)督聚類，將細胞分為不同的LCSC marker組。盡管病例個體與LCSC marker組狀態(tài)存在一定的相關性，但同時表達EPCAM、ALDH1A1 和 CD24 的 LCSC marker組2的細胞聚集在一起并包含來自多個病例的 HCC 腫瘤細胞。它們可能代表一個分子上不同的腫瘤細胞亞群。此外，研究者為每個病例的HCC腫瘤細胞生成了全基因組CNV圖譜，并根據CNV變異程度構建HCC腫瘤細胞的譜系層次，共獲得9個CNV組，且RTK家族基因表達特征具有患者間的異質性�？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明個體病例的HCC腫瘤細胞基于全局轉錄組特征、LCSC marker、推斷的CNV狀態(tài)和RTK基因表達四個方面的相似性聚類在一起，從而證實腫瘤間異質性程度比腫瘤內更強。然而，每個HCC腫瘤中有主要和次要細胞亞克隆，說明腫瘤內異質性水平不可忽視，這可能會給傳統(tǒng)通過精確定位主要亞克隆的分子靶向治療帶來困難。

Fig.4 LCSC marker和推斷的CNV狀態(tài)方面的腫瘤異質性

主要結論
研究者利用單細胞轉錄組測序技術探究了一組HBV相關的HCC患者的免疫譜和腫瘤異質性，并發(fā)現(xiàn)腫瘤相關巨噬細胞抑制腫瘤T細胞浸潤，TIGIT-NECTIN2 相互作用調節(jié)免疫抑制環(huán)境。免疫細胞向更具免疫抑制性和耗竭性的細胞狀態(tài)轉變體現(xiàn)了促進癌癥發(fā)展的整體免疫細胞譜。此外，全局分子特征的異質性揭示了共存的腫瘤內和腫瘤間異質性，且腫瘤間異質性更明顯。這種免疫抑制譜和細胞間相互作用的分析為設計有效的肝細胞癌免疫療法提供了機制信息。

參考文獻：
Ho, Daniel Wai-Hung et al. “Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma.” Nature communications vol. 12,1 3684. 17 Jun, 2021.