云序測(cè)序技術(shù)在赫捷院士團(tuán)隊(duì)揭密肺腺癌m6A機(jī)制的應(yīng)用
繼前面介紹中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院赫捷院士團(tuán)隊(duì)2021年6月21日在Nature Communications（IF=14.919）上發(fā)表“METTL3 promotes tumour developmentby decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding”的食管鱗癌 m6A機(jī)制文章后，本期我們繼續(xù)為大家介紹赫捷院士團(tuán)隊(duì) 2021 年 5 月 8 日在 Nature 旗下期刊 Cell Death & Disease（IF=8.47）上發(fā)表的題為 “WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis” 的肺腺癌 m6A機(jī)制文章。該研究揭示了一種 Wnt/β-catenin 介導(dǎo)的 FTO 下調(diào)的關(guān)鍵機(jī)制，并凸顯了 MYC mRNA 的 m6A 修飾在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖酵解和生長(zhǎng)中的作用。云序生物有幸參與了兩次研究當(dāng)中的m6A MeRIP-seq和RNA-seq的測(cè)序服務(wù)以及生信分析。
發(fā)表期刊：Cell Death & Disease
發(fā)表日期：2021年5月8日
影響因子：8.47
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP、Co-IP 實(shí)驗(yàn)等
文章鏈接：WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis
一、FTO表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)肺腺癌（Lung Adenocarcinoma）的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)TO 下調(diào)越嚴(yán)重，病患的生存率越低
作者首先從 TCGA 的公開(kāi)數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中的 FTO 表達(dá)水平低于鄰近的正常組織，然后對(duì) FTO 的 mRNA 進(jìn)行 qPCR 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了這種表達(dá)差異的存在。免疫組化染色實(shí)驗(yàn)也證實(shí) FTO 的的表達(dá)水平在肺腺癌組織中要低于鄰近的正常組織。Kaplan-Meier 分析顯示，低 FTO 表達(dá)水平的病患擁有較低的總生存率。
在人類(lèi)肺腺癌細(xì)胞系中對(duì) FTO 的 mRNA 的敲降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 表達(dá)的降低可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖以及非錨定依賴性生長(zhǎng)（Anchorage-independed growth）的能力，細(xì)胞周期的速度也更快，細(xì)胞遷移和侵入性也更強(qiáng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，若將 FTO 敲降的細(xì)胞系注入無(wú)胸腺裸鼠的尾靜脈內(nèi)，相比于注入未敲降細(xì)胞的對(duì)照組，F(xiàn)TO 敲降的實(shí)驗(yàn)組中的腫瘤細(xì)胞有明顯地向肺部轉(zhuǎn)移。
上述發(fā)現(xiàn)都指向一個(gè)結(jié)論：FTO 在肺腺癌細(xì)胞中的下調(diào)促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
二、Wnt 信號(hào)通路提高了 FTO 啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白 H3K27me3 甲基化，從而抑制 FTO 的表達(dá)
肺腺癌細(xì)胞中的 FTO 的表達(dá)是因?yàn)槭裁丛蚨抡{(diào)的呢？為了回答這個(gè)問(wèn)題，作者用 PROMO 軟件分析 FTO 基因的啟動(dòng)子序列，在其中找到了 3 個(gè)有可能是 TBE 元件（LEF/TCF-binding element）的區(qū)域。為了驗(yàn)證生信預(yù)測(cè)的真實(shí)性，作者又進(jìn)行了了一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。首先，ChIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 TCF4 與 FTO 啟動(dòng)子的結(jié)合。另外，熒光素酶報(bào)告基因的結(jié)果顯示，β-catenin 也可通過(guò)結(jié)合前述的 3 個(gè) TBE 元件來(lái)抑制 FTO 啟動(dòng)子。因此，β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體被證明可以抑制 FTO 啟動(dòng)子的活性。人類(lèi)肺腺癌細(xì)胞系經(jīng)過(guò) Wnt 處理后，F(xiàn)TO 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均有所降低，并且這種現(xiàn)象可通過(guò)敲降 β-catenin 來(lái)逆轉(zhuǎn)。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明：Wnt 在信號(hào)通路的上游，通過(guò)誘導(dǎo) β-catenin，使得β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體結(jié)合到 FTO 啟動(dòng)子上，最終抑制了 FTO 的表達(dá)。
那么，Wnt 信號(hào)通路到底是怎么抑制 FTO 啟動(dòng)子的呢？作者通過(guò)ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 基因啟動(dòng)子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域附近的組蛋白存在 H3K27me3 的甲基化修飾現(xiàn)象。學(xué)界在先前的研究中已經(jīng)知曉，EZH2 是一種負(fù)責(zé)組蛋白 H3K27me3 甲基化修飾的酶。通過(guò)Co-IP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Wnt 刺激可以促進(jìn) EZH2 與 β-catenin 的結(jié)合；通過(guò) ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Wnt 刺激也可以促進(jìn) EZH2 與 TBE 元件的結(jié)合。并且，敲降 EZH2 可阻斷 Wnt 對(duì) FTO 表達(dá)的抑制作用。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明：Wnt 信號(hào)誘導(dǎo)了 EZH2 與 β-catenin 的結(jié)合，導(dǎo)致了 FTO 啟動(dòng)子附近的組蛋白發(fā)生 H3K27me3 甲基化修飾，從而抑制 FTO 表達(dá)。
三、FTO 表達(dá)下調(diào)可提高 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平，從而促進(jìn) c-Myc 的表達(dá)
在肺腺癌細(xì)胞當(dāng)中，哪些 RNA 會(huì)受 FTO 表達(dá)下調(diào)的調(diào)控，進(jìn)而引發(fā)肺腺癌呢？為了探明 FTO 下游的分子致病原因，作者進(jìn)行了 m6A 甲基化測(cè)序，發(fā)現(xiàn) FTO 敲降的肺腺癌細(xì)胞當(dāng)中有大量基因的 mRNA m6A 甲基化上調(diào)。FTO 是一種典型的 RNA m6A 甲基化的去修飾酶（也就是 m6A 的 “Eraser”），可以消去 m6A 甲基化，還原出普通的 A 堿基。通過(guò)云序生物m6A MeRIP-seq發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO敲降細(xì)胞中有 556 個(gè)基因的 mRNA的 m6A 修飾水平升高；生信分析也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 敲降細(xì)胞的代謝通路當(dāng)中有許多基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高，其中就包括一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子 MYC。m6A MeRIP-seq的結(jié)果可以驗(yàn)證，當(dāng)敲降了 FTO 之后，MYC 基因的 mRNA 的終止密碼子附近的 m6A 修飾水平升高。通過(guò)云序生物m6A MeRIP-qPCR 實(shí)驗(yàn) 結(jié)果也證實(shí)，F(xiàn)TO 的敲降可以提升 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。針對(duì) FTO 蛋白的 RIP 實(shí)驗(yàn)更是直接證明，F(xiàn)TO 結(jié)合在 MYC 的 mRNA 上面。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明，F(xiàn)TO 可結(jié)合 MYC 的 mRNA，從而降低 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。
那么，c-Myc 蛋白的表達(dá)水平又是如何受到調(diào)控的呢？作者設(shè)計(jì)了熒光素酶報(bào)告基因，將熒光素酶報(bào)告基因插入 MYC 的 mRNA 中，并將實(shí)驗(yàn)組的 mRNA 3’ 端的 m6A 突變?yōu)槠渌鼔A基，對(duì)照組的 MYC mRNA 則不做任何堿基修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 敲降后，對(duì)照組的 MYC mRNA 表達(dá)了大量熒光素酶，但經(jīng)過(guò)堿基突變而不再具有 m6A 的實(shí)驗(yàn)組則沒(méi)有熒光素酶信號(hào)，說(shuō)明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 對(duì)于蛋白的成功翻譯不可或缺。相反地，如果過(guò)表達(dá) FTO，那么肺腺癌細(xì)胞系的 c-Myc 蛋白的表達(dá)量會(huì)下降。但是，無(wú)論是 FTO 敲降還是過(guò)表達(dá)，MYC 的 mRNA 水平都沒(méi)有改變。綜上可知，c-Myc 蛋白表達(dá)量的變化，與 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平正相關(guān)，而與 MYC mRNA 的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。
四、YTHDF1 通過(guò)結(jié)合 m6A 修飾的 MYC mRNA 來(lái)促進(jìn)其翻譯
既然 FTO 敲降所導(dǎo)致的 c-Myc 蛋白的表達(dá)水平上升并不是由 MYC mRNA 表達(dá)水平的變化造成的，那么造成這一現(xiàn)象的原因會(huì)是什么呢？會(huì)不會(huì)是 mRNA 翻譯調(diào)控呢？YTHDF1 是一種典型的 RNA m6A 甲基化識(shí)別蛋白（也就是 m6A 的 “Reader”）。用 anti-YTHDF1 抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) FTO 的敲降將會(huì)增強(qiáng) YTHDF1 與 MYC mRNA 的結(jié)合。雖然敲降 YTHDF1 并沒(méi)有影響 MYC mRNA 的表達(dá)水平，但卻能降低 c-Myc 蛋白的表達(dá)水平。在上一段中發(fā)現(xiàn)的 FTO 的敲降所導(dǎo)致的 c-Myc 蛋白表達(dá)水平的上升，還會(huì)被 YTHDF1 的敲降所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明 YTHDF1 發(fā)揮功能的位置在 FTO 的下游和 c-Myc 的上游 。綜上可知，F(xiàn)TO 表達(dá)下調(diào)所導(dǎo)致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識(shí)別并結(jié)合，從而促進(jìn) MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
五、FTO 表達(dá)下調(diào)所誘導(dǎo)的 c-Myc 表達(dá)，可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的糖酵解、生長(zhǎng)、遷移、侵入和腫瘤發(fā)生
c-Myc 蛋白在癌癥的代謝當(dāng)中扮演重要的角色，因此作者就 c-Myc 的高表達(dá)在肺腺癌當(dāng)中所發(fā)揮的作用進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。首先，在小鼠肺腺癌細(xì)胞系中，F(xiàn)TO 敲降的細(xì)胞表現(xiàn)出己糖激酶-2（HK2） mRNA 和蛋白高表達(dá)的現(xiàn)象，說(shuō)明 FTO 敲降細(xì)胞的糖酵解活躍。并且，F(xiàn)TO 敲降誘導(dǎo)的 HK-2 高表達(dá)現(xiàn)象，可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明 c-Myc 發(fā)揮功能的位置在 FTO 的下游和己糖激酶的上游。類(lèi)似地，F(xiàn)TO 敲降細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳糖生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵入能力等均有升高，且這些升高現(xiàn)象均可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)。
作者進(jìn)一步進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)，注入 FTO 敲降的肺腺癌細(xì)胞系可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，且該生長(zhǎng)促進(jìn)的現(xiàn)象可被 c-Myc 的敲降所逆轉(zhuǎn)。免疫組化染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在注入了 FTO 敲降細(xì)胞的腫瘤組織當(dāng)中，c-Myc、HK-2 以及 Ki67（一種細(xì)胞增殖的標(biāo)志物）均有高表達(dá)，且該現(xiàn)象可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)。此外，注入了 FTO 敲降細(xì)胞的裸鼠發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，且這種轉(zhuǎn)移可被 c-Myc 敲降所抑制。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明：FTO 表達(dá)下調(diào)所誘導(dǎo)的 c-Myc 表達(dá)，可在小鼠體內(nèi)促進(jìn)肺腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
在本研究當(dāng)中，作者發(fā)現(xiàn)：
本篇論文體現(xiàn)了從酶出發(fā)研究 RNA 的 m6A 修飾的一種經(jīng)典研究思路。
首先，作者發(fā)現(xiàn)了肺腺癌當(dāng)中 m6A 去修飾化酶 FTO 的異常低表達(dá)，就此選定 FTO 這個(gè)酶為研究對(duì)象。緊接著，作者敲降 FTO 以控制變量，以研究 FTO 這個(gè)酶在肺腺癌中所發(fā)揮的功能。下一步，作者從上游和下游兩個(gè)方向篩選出與 FTO 基因或 FTO蛋白發(fā)生互作的分子：一方面，通過(guò)一系列Co-IP、ChIP 和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，作者證明 FTO 基因是 Wnt 信號(hào)通路的靶基因，Wnt 誘導(dǎo)的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體結(jié)合于 FTO 基因啟動(dòng)子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域，通過(guò)組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，通過(guò)m6A MeRIP-seq 和生信預(yù)測(cè)，作者篩選出 MYC 作為 FTO 蛋白的靶基因，并通過(guò)一系列的MeRIP-qPCR、RIP 和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，證明 c-Myc 蛋白的表達(dá)量是跟隨 FTO 蛋白表達(dá)量變化的因變量。
在研究了 FTO 對(duì)肺腺癌的作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，作者還進(jìn)一步探索了 m6A 識(shí)別蛋白 YTHDF1 在肺腺癌中扮演的角色。首先，通過(guò) RIP實(shí)驗(yàn)，作者證明了 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結(jié)合。隨后，通過(guò)結(jié)合 FTO 敲降和 YTHDF1 敲降實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明 FTO 表達(dá)下調(diào)所導(dǎo)致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識(shí)別并結(jié)合，從而促進(jìn) MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
在本研究當(dāng)中，肺腺癌致病機(jī)理當(dāng)中的 “Eraser” 和 “Reader” 都得到了闡釋。這些新發(fā)現(xiàn)對(duì)于肺腺癌的治療提供了一種全新的潛在思路。
發(fā)表期刊：Cell Death & Disease
發(fā)表日期：2021年5月8日
影響因子：8.47
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP、Co-IP 實(shí)驗(yàn)等
文章鏈接：WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis
研究?jī)?nèi)容
一、FTO表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)肺腺癌（Lung Adenocarcinoma）的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)TO 下調(diào)越嚴(yán)重，病患的生存率越低
作者首先從 TCGA 的公開(kāi)數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中的 FTO 表達(dá)水平低于鄰近的正常組織，然后對(duì) FTO 的 mRNA 進(jìn)行 qPCR 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了這種表達(dá)差異的存在。免疫組化染色實(shí)驗(yàn)也證實(shí) FTO 的的表達(dá)水平在肺腺癌組織中要低于鄰近的正常組織。Kaplan-Meier 分析顯示，低 FTO 表達(dá)水平的病患擁有較低的總生存率。
在人類(lèi)肺腺癌細(xì)胞系中對(duì) FTO 的 mRNA 的敲降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 表達(dá)的降低可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖以及非錨定依賴性生長(zhǎng)（Anchorage-independed growth）的能力，細(xì)胞周期的速度也更快，細(xì)胞遷移和侵入性也更強(qiáng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，若將 FTO 敲降的細(xì)胞系注入無(wú)胸腺裸鼠的尾靜脈內(nèi)，相比于注入未敲降細(xì)胞的對(duì)照組，F(xiàn)TO 敲降的實(shí)驗(yàn)組中的腫瘤細(xì)胞有明顯地向肺部轉(zhuǎn)移。
上述發(fā)現(xiàn)都指向一個(gè)結(jié)論：FTO 在肺腺癌細(xì)胞中的下調(diào)促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
二、Wnt 信號(hào)通路提高了 FTO 啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白 H3K27me3 甲基化，從而抑制 FTO 的表達(dá)
肺腺癌細(xì)胞中的 FTO 的表達(dá)是因?yàn)槭裁丛蚨抡{(diào)的呢？為了回答這個(gè)問(wèn)題，作者用 PROMO 軟件分析 FTO 基因的啟動(dòng)子序列，在其中找到了 3 個(gè)有可能是 TBE 元件（LEF/TCF-binding element）的區(qū)域。為了驗(yàn)證生信預(yù)測(cè)的真實(shí)性，作者又進(jìn)行了了一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。首先，ChIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 TCF4 與 FTO 啟動(dòng)子的結(jié)合。另外，熒光素酶報(bào)告基因的結(jié)果顯示，β-catenin 也可通過(guò)結(jié)合前述的 3 個(gè) TBE 元件來(lái)抑制 FTO 啟動(dòng)子。因此，β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體被證明可以抑制 FTO 啟動(dòng)子的活性。人類(lèi)肺腺癌細(xì)胞系經(jīng)過(guò) Wnt 處理后，F(xiàn)TO 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均有所降低，并且這種現(xiàn)象可通過(guò)敲降 β-catenin 來(lái)逆轉(zhuǎn)。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明：Wnt 在信號(hào)通路的上游，通過(guò)誘導(dǎo) β-catenin，使得β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體結(jié)合到 FTO 啟動(dòng)子上，最終抑制了 FTO 的表達(dá)。
那么，Wnt 信號(hào)通路到底是怎么抑制 FTO 啟動(dòng)子的呢？作者通過(guò)ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 基因啟動(dòng)子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域附近的組蛋白存在 H3K27me3 的甲基化修飾現(xiàn)象。學(xué)界在先前的研究中已經(jīng)知曉，EZH2 是一種負(fù)責(zé)組蛋白 H3K27me3 甲基化修飾的酶。通過(guò)Co-IP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Wnt 刺激可以促進(jìn) EZH2 與 β-catenin 的結(jié)合；通過(guò) ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Wnt 刺激也可以促進(jìn) EZH2 與 TBE 元件的結(jié)合。并且，敲降 EZH2 可阻斷 Wnt 對(duì) FTO 表達(dá)的抑制作用。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明：Wnt 信號(hào)誘導(dǎo)了 EZH2 與 β-catenin 的結(jié)合，導(dǎo)致了 FTO 啟動(dòng)子附近的組蛋白發(fā)生 H3K27me3 甲基化修飾，從而抑制 FTO 表達(dá)。
在肺腺癌細(xì)胞當(dāng)中，哪些 RNA 會(huì)受 FTO 表達(dá)下調(diào)的調(diào)控，進(jìn)而引發(fā)肺腺癌呢？為了探明 FTO 下游的分子致病原因，作者進(jìn)行了 m6A 甲基化測(cè)序，發(fā)現(xiàn) FTO 敲降的肺腺癌細(xì)胞當(dāng)中有大量基因的 mRNA m6A 甲基化上調(diào)。FTO 是一種典型的 RNA m6A 甲基化的去修飾酶（也就是 m6A 的 “Eraser”），可以消去 m6A 甲基化，還原出普通的 A 堿基。通過(guò)云序生物m6A MeRIP-seq發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO敲降細(xì)胞中有 556 個(gè)基因的 mRNA的 m6A 修飾水平升高；生信分析也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 敲降細(xì)胞的代謝通路當(dāng)中有許多基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高，其中就包括一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子 MYC。m6A MeRIP-seq的結(jié)果可以驗(yàn)證，當(dāng)敲降了 FTO 之后，MYC 基因的 mRNA 的終止密碼子附近的 m6A 修飾水平升高。通過(guò)云序生物m6A MeRIP-qPCR 實(shí)驗(yàn) 結(jié)果也證實(shí)，F(xiàn)TO 的敲降可以提升 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。針對(duì) FTO 蛋白的 RIP 實(shí)驗(yàn)更是直接證明，F(xiàn)TO 結(jié)合在 MYC 的 mRNA 上面。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明，F(xiàn)TO 可結(jié)合 MYC 的 mRNA，從而降低 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。
那么，c-Myc 蛋白的表達(dá)水平又是如何受到調(diào)控的呢？作者設(shè)計(jì)了熒光素酶報(bào)告基因，將熒光素酶報(bào)告基因插入 MYC 的 mRNA 中，并將實(shí)驗(yàn)組的 mRNA 3’ 端的 m6A 突變?yōu)槠渌鼔A基，對(duì)照組的 MYC mRNA 則不做任何堿基修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 敲降后，對(duì)照組的 MYC mRNA 表達(dá)了大量熒光素酶，但經(jīng)過(guò)堿基突變而不再具有 m6A 的實(shí)驗(yàn)組則沒(méi)有熒光素酶信號(hào)，說(shuō)明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 對(duì)于蛋白的成功翻譯不可或缺。相反地，如果過(guò)表達(dá) FTO，那么肺腺癌細(xì)胞系的 c-Myc 蛋白的表達(dá)量會(huì)下降。但是，無(wú)論是 FTO 敲降還是過(guò)表達(dá)，MYC 的 mRNA 水平都沒(méi)有改變。綜上可知，c-Myc 蛋白表達(dá)量的變化，與 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平正相關(guān)，而與 MYC mRNA 的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。
四、YTHDF1 通過(guò)結(jié)合 m6A 修飾的 MYC mRNA 來(lái)促進(jìn)其翻譯
既然 FTO 敲降所導(dǎo)致的 c-Myc 蛋白的表達(dá)水平上升并不是由 MYC mRNA 表達(dá)水平的變化造成的，那么造成這一現(xiàn)象的原因會(huì)是什么呢？會(huì)不會(huì)是 mRNA 翻譯調(diào)控呢？YTHDF1 是一種典型的 RNA m6A 甲基化識(shí)別蛋白（也就是 m6A 的 “Reader”）。用 anti-YTHDF1 抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) FTO 的敲降將會(huì)增強(qiáng) YTHDF1 與 MYC mRNA 的結(jié)合。雖然敲降 YTHDF1 并沒(méi)有影響 MYC mRNA 的表達(dá)水平，但卻能降低 c-Myc 蛋白的表達(dá)水平。在上一段中發(fā)現(xiàn)的 FTO 的敲降所導(dǎo)致的 c-Myc 蛋白表達(dá)水平的上升，還會(huì)被 YTHDF1 的敲降所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明 YTHDF1 發(fā)揮功能的位置在 FTO 的下游和 c-Myc 的上游 。綜上可知，F(xiàn)TO 表達(dá)下調(diào)所導(dǎo)致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識(shí)別并結(jié)合，從而促進(jìn) MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
五、FTO 表達(dá)下調(diào)所誘導(dǎo)的 c-Myc 表達(dá)，可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的糖酵解、生長(zhǎng)、遷移、侵入和腫瘤發(fā)生
c-Myc 蛋白在癌癥的代謝當(dāng)中扮演重要的角色，因此作者就 c-Myc 的高表達(dá)在肺腺癌當(dāng)中所發(fā)揮的作用進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。首先，在小鼠肺腺癌細(xì)胞系中，F(xiàn)TO 敲降的細(xì)胞表現(xiàn)出己糖激酶-2（HK2） mRNA 和蛋白高表達(dá)的現(xiàn)象，說(shuō)明 FTO 敲降細(xì)胞的糖酵解活躍。并且，F(xiàn)TO 敲降誘導(dǎo)的 HK-2 高表達(dá)現(xiàn)象，可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明 c-Myc 發(fā)揮功能的位置在 FTO 的下游和己糖激酶的上游。類(lèi)似地，F(xiàn)TO 敲降細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳糖生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵入能力等均有升高，且這些升高現(xiàn)象均可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)。
作者進(jìn)一步進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)，注入 FTO 敲降的肺腺癌細(xì)胞系可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，且該生長(zhǎng)促進(jìn)的現(xiàn)象可被 c-Myc 的敲降所逆轉(zhuǎn)。免疫組化染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在注入了 FTO 敲降細(xì)胞的腫瘤組織當(dāng)中，c-Myc、HK-2 以及 Ki67（一種細(xì)胞增殖的標(biāo)志物）均有高表達(dá)，且該現(xiàn)象可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)。此外，注入了 FTO 敲降細(xì)胞的裸鼠發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，且這種轉(zhuǎn)移可被 c-Myc 敲降所抑制。綜合前面的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)可以證明：FTO 表達(dá)下調(diào)所誘導(dǎo)的 c-Myc 表達(dá)，可在小鼠體內(nèi)促進(jìn)肺腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
要點(diǎn)總結(jié)
在本研究當(dāng)中，作者發(fā)現(xiàn)：
- 肺腺癌組織當(dāng)中，m6A 的去修飾化酶 FTO 的表達(dá)水平存在下調(diào)。
- Wnt 信號(hào)誘導(dǎo)的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體結(jié)合于 FTO 基因啟動(dòng)子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域，通過(guò)組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉(zhuǎn)錄。
- 通過(guò)m6A MeRIP-seq發(fā)現(xiàn)FTO 的表達(dá)下調(diào)使得包含 MYC 在內(nèi)的多種代謝相關(guān)基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高。
- MYC mRNA 的 m6A 修飾可以募集 m6A 識(shí)別蛋白 YTHDF1 的結(jié)合，從而促進(jìn) c-Myc 蛋白的翻譯表達(dá)，進(jìn)而提升腫瘤細(xì)胞的糖酵解水平和細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。
云序點(diǎn)評(píng)
本篇論文體現(xiàn)了從酶出發(fā)研究 RNA 的 m6A 修飾的一種經(jīng)典研究思路。
首先，作者發(fā)現(xiàn)了肺腺癌當(dāng)中 m6A 去修飾化酶 FTO 的異常低表達(dá)，就此選定 FTO 這個(gè)酶為研究對(duì)象。緊接著，作者敲降 FTO 以控制變量，以研究 FTO 這個(gè)酶在肺腺癌中所發(fā)揮的功能。下一步，作者從上游和下游兩個(gè)方向篩選出與 FTO 基因或 FTO蛋白發(fā)生互作的分子：一方面，通過(guò)一系列Co-IP、ChIP 和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，作者證明 FTO 基因是 Wnt 信號(hào)通路的靶基因，Wnt 誘導(dǎo)的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復(fù)合體結(jié)合于 FTO 基因啟動(dòng)子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域，通過(guò)組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，通過(guò)m6A MeRIP-seq 和生信預(yù)測(cè)，作者篩選出 MYC 作為 FTO 蛋白的靶基因，并通過(guò)一系列的MeRIP-qPCR、RIP 和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，證明 c-Myc 蛋白的表達(dá)量是跟隨 FTO 蛋白表達(dá)量變化的因變量。
在研究了 FTO 對(duì)肺腺癌的作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，作者還進(jìn)一步探索了 m6A 識(shí)別蛋白 YTHDF1 在肺腺癌中扮演的角色。首先，通過(guò) RIP實(shí)驗(yàn)，作者證明了 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結(jié)合。隨后，通過(guò)結(jié)合 FTO 敲降和 YTHDF1 敲降實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明 FTO 表達(dá)下調(diào)所導(dǎo)致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識(shí)別并結(jié)合，從而促進(jìn) MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
在本研究當(dāng)中，肺腺癌致病機(jī)理當(dāng)中的 “Eraser” 和 “Reader” 都得到了闡釋。這些新發(fā)現(xiàn)對(duì)于肺腺癌的治療提供了一種全新的潛在思路。
- MeRIP-seq等揭示m6A甲基化及調(diào)控因子在食管胃結(jié)合部腺癌中的作用
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