MeRIP-Seq & RIP-Seq在肺動脈高壓m6A蛋白YTHDF1機(jī)制研究的應(yīng)用

N6-甲基腺苷（m6A）是最普遍的mRNA內(nèi)部修飾，通過甲基化酶（writer）、去甲基化化酶（eraser）和閱讀蛋白（reader）的合作參與細(xì)胞過程。m6A對mRNA下游調(diào)控如翻譯、輸出和穩(wěn)定性的影響主要由識別修飾靶點(diǎn)的reader決定。云序客戶南京醫(yī)科大學(xué)陳峰課題組在American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 雜志（IF=21.405）上發(fā)表了關(guān)于m6A reader蛋白在肺動脈高壓（PAH）發(fā)病機(jī)制中作用的文章，展示了人類PAH患者和實(shí)驗(yàn)性PH模型中m6A水平和YTHDF1 reader蛋白表達(dá)，YTHDF1 reader蛋白的機(jī)制作用，并表明針對YTHDF1或MAGED1的策略可能是治療PH的有效療法。云序生物有幸參與本項(xiàng)目當(dāng)中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq以及生信分析。
下面我們就為大家解析這篇研究reader蛋白的文章思路和成果。 發(fā)表期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
發(fā)表日期：2021年5月1日
影響因子：21.405
研究方法：比色法檢測m6A整體水平、m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq、MeRIP-qPCR
文章鏈接：YTHDF1 Regulates Pulmonary Hypertension through Translational Control of MAGED1
    一、m6A修飾水平在人類PAH患者和實(shí)驗(yàn)性PH模型中上調(diào)
首先，作者用比色法檢測了PAH患者（n=7）和Su/Hx誘導(dǎo)PAH小鼠的肺組織（n=8）、MCT誘導(dǎo)大鼠的肺動脈組織（n=8），發(fā)現(xiàn)與對應(yīng)的健康組織相比整體m6A甲基化水平上調(diào)。同時，也發(fā)現(xiàn)在PAH組織中，m6A reader蛋白YTHDF1的表達(dá)上調(diào)。并且，YTHDF1蛋白表達(dá)量和RNA整體m6A水平都隨著缺氧時間一起增加。這些結(jié)果提示了YTHDF1與m6A修飾可能參與了PH病理生理過程。
二、YTHDF1基因敲除改善PH
為驗(yàn)證YTHDF1對PH病理生理過程的影響，一方面作者在小鼠中敲降YTHDF1進(jìn)行Su/Hx誘導(dǎo)PH實(shí)驗(yàn)，通過血液動力學(xué)、肺動脈血管壁厚度和肌化、肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)敲降YTHDF1可改善小鼠PH和PVR發(fā)展。另一方面，目前已知PASMC細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在PH的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，作者在 HPASMC中敲降YTHDF1，發(fā)現(xiàn)可改善細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)換和凋亡抵抗。
三、YTHDF1蛋白表達(dá)增加與蛋白降解改變有關(guān)
有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)雖然YTHDF1蛋白表達(dá)量在PH患者和動物模型中上調(diào)，但是YTHDF1的mRNA卻不變甚至輕微下調(diào)。于是作者通過轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)和蛋白合成抑制試驗(yàn)在HPASMCs中驗(yàn)證到，缺氧誘導(dǎo)PH過程中YTHDF1轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性不變而蛋
四、MAGED1是Su/Hx處理小鼠m6A修飾和YTHDF1的靶點(diǎn)
為了尋找YTHDF1作用的靶基因，作者對Su/Hx誘發(fā)PH的小鼠和對照小鼠進(jìn)行了m6A MeRIP-seq、RNA-seq和RIP-seq。m6A修飾譜展現(xiàn)了m6A位點(diǎn)多分布在終止密碼子，甲基化峰保守序列分析顯示RRACH序列顯著富集。對三組學(xué)差異基因取交集后進(jìn)行了GO和KEGG分析。

 

圖片處理組m6A修飾水平上調(diào)且與YTHDF1結(jié)合的基因中，MAGED1基因的功能與細(xì)胞凋亡、分化和增殖相關(guān)，篩選其為潛在靶基因。與對照組相比，在Su/Hx處理小鼠中，作者通過MeRIP-qPCR驗(yàn)證了MAGED1的m6A修飾水平升高，通過RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證到結(jié)合YTHDF1的MAGED1蛋白更加富集。另外，同樣進(jìn)行Su/Hx處理，在敲降YTHDF1的小鼠MAGED1蛋白表達(dá)量低于野生型。這些結(jié)果表明，Su/Hx誘導(dǎo)PH的模型小鼠中，MAGED1蛋白經(jīng)由m6A修飾受YTHDF1調(diào)控。
五、YTHDF1識別并促進(jìn)m6A修飾的MAGED1 mRNA的翻譯
接下來作者探究了YTHDF1調(diào)控MAGED1的機(jī)制。作者觀察到在患者和小鼠模型中，MAGED1蛋白水平隨著促PH因子的作用而升高，但MAGED1基因mRNA卻沒有顯著差異。于是針對YTHDF1作者1) 通過RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)PH的小鼠中YTHDF1結(jié)合的MAGED1 mRNA更加富集; 2)通過敲降和過表達(dá)YTHDF1發(fā)現(xiàn)影響MAGED1蛋白表達(dá)而不是mRNA水平；3）通過CHX處理區(qū)分驗(yàn)證了HPASMCs中過表達(dá)YTHDF1不改變MAGED1蛋白降解速率，說明YTHDF1是通過影響翻譯效率實(shí)現(xiàn)提高M(jìn)AGED1蛋白表達(dá)。除此之外，作者還在過表達(dá)YTHDF1的HPASMCs中敲降了甲基化酶METTL3，發(fā)現(xiàn)會減弱YTHDF1促進(jìn)MAGED1蛋白表達(dá)的效果。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，YTHDF1通過促進(jìn)帶有m6A修飾的靶基因MAGED1的蛋白翻譯效率從而增強(qiáng)其蛋白表達(dá)。
六、靶基因MAGED1對PH的促進(jìn)作用
最后作者研究了靶基因MAGED1對PH病理生理過程的影響。通過動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了敲降MAGED1對PH小鼠血管重塑和心功能損害具有保護(hù)作用，進(jìn)一步又驗(yàn)證了MAGED1通過上調(diào)PCNA促進(jìn)缺氧狀態(tài)下PASMC的細(xì)胞增殖、遷移和存活。

 

總結(jié)

這篇文章首先通過比色法檢測了PH中整體m6A修飾水平上調(diào)，m6A reader蛋白YTHDF1表達(dá)上調(diào)，揭示了m6A修飾在PH病理生理學(xué)中的潛在作用。然后通過云序生物提供的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq尋找m6A修飾和受YTHDF1調(diào)控的靶基因MAGED1。在疾病患者、模型小鼠、PASMC細(xì)胞中，一方面驗(yàn)證了YTHDF1 reader蛋白在疾病中表達(dá)提高，另一方面從結(jié)合mRNA、調(diào)控mRNA和蛋白表達(dá)水平等方面，驗(yàn)證了YTHDF1通過m6A修飾促進(jìn)靶基因MAGED1的蛋白表達(dá)。最后驗(yàn)證了靶基因MAGED1對PH的促進(jìn)作用。本研究首次將m6A水平和YTHDF1豐度的增加與PH的發(fā)展聯(lián)系起來，并表明針對YTHDF1或MAGED1的干預(yù)可能是治療PH的有效方法。