關(guān)于4D蛋白質(zhì)組學技術(shù)和其應(yīng)用方式問題解答（二）

相較于傳統(tǒng)3D技術(shù)方法，基于4D平臺的蛋白質(zhì)組學無論是在鑒定深度還是準確性上都能帶來全面的提升。關(guān)于4D蛋白質(zhì)組學，小編在上期- 關(guān)于4D蛋白質(zhì)組學，你想知道的那些事兒（一）為大家?guī)�來了關(guān)于4D-shot gun的Q&A，今天一起來看看對于4D-Label free又有哪些常見問題吧。

篇章二 
4D-Label free：不需要對樣品進行任何標記，每個樣品可單獨上機。利用DDA采集模式分析直接酶解后的蛋白肽段，獲得蛋白質(zhì)表達量變化情況，對蛋白進行定性定量分析。


同步累積連續(xù)碎裂（PASEF®）示意圖。timsTOF Pro質(zhì)譜儀的PASEF策略，離子在第一個TIMS分析器中進行累積和聚焦，同時第二個TIMS分析器對肽段進行淌度分離和逐步釋放。
圖片來源：BRUKER


Q1：為什么叫做Label free？
A：提到Label free就不得不提到iTRAQ和TMT，iTRAQ和TMT分別是由Thermo Fisher和AB SCIEX研發(fā)的多肽體外標記定量技術(shù)，也是運用廣泛的兩種標記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)，具有相似的原理，兩者主要區(qū)別在于：TMT最高可同時標記16組不同的生物樣品，iTRAQ最高可同時標記8組不同的生物樣品。

與上述兩種多肽體外標記定量技術(shù)不同，Label free無需使用昂貴的穩(wěn)定同位素標簽做內(nèi)部標準，每個樣品單獨上機，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號強度，從而對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進行相對定量。其優(yōu)勢是無需依賴同位素標記，每例單獨檢測，因此實驗設(shè)計靈活，適合臨床大幾十例、上百例樣本的檢測，同時也能看到樣本中的“有還是無”的蛋白。缺點是對儀器的穩(wěn)定性、實驗人員的操作等可能產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的因素要求極高。

Q2：4D-Label free為什么更具優(yōu)勢？
A：Label free每條肽段的豐度（量）與其在MS1中的峰面積或信號強度成正比；而不同樣品的同一條肽段在LC上的保留時間（retention time, RT）是一致的，因此，可以通過對比MS圖譜，再整合到相應(yīng)蛋白，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)在不同樣品中的相對表達水平的定量分析。由于常規(guī)DDA模式的Label free是基于topN的方法挑選母離子進行二級碎裂的，所以難免會損失一些豐度較低的信號。4D-Label free由于增加了第四個維度-離子淌度（mobility）作為額外的一個數(shù)據(jù)對齊參數(shù)顯著減少了missing value，提高定量的準確性，因此定性和定量數(shù)據(jù)更穩(wěn)定。

      蛋白質(zhì)磷酸化修飾調(diào)節(jié)著蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)、定位、折疊以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的交互作用等。許多至關(guān)重要的生命進程不僅由蛋白質(zhì)的相對豐度控制，更重要的是被那些時空特異分布的翻譯后修飾控制。因此，除了對基因組所編碼的“裸”蛋白質(zhì)組的研究以外，更需要對經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組的調(diào)控過程進行深入的研究。由于磷酸化修飾會導致空間結(jié)構(gòu)的微變化，常規(guī)3D分析不能完全區(qū)分，所以離子淌度（mobility）的引入使得4D-label free磷酸化鑒定更具優(yōu)勢。


Q3：4D-Label free有哪些應(yīng)用研究案例？
A：案例一：In-depth proteomics and natural peptidomics analyses reveal antibacterial peptides in human endometrial fluid
摘要：2020年，西班牙巴斯克地區(qū)大學的研究團隊對子宮內(nèi)膜液的蛋白質(zhì)和天然肽進行了全面分析。使用高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析了來自11個個體的樣品的蛋白質(zhì)含量。鑒定了4694種蛋白質(zhì)以及3899種天然存在的肽。實驗結(jié)果大大擴展了已知子宮內(nèi)膜液蛋白質(zhì)的目錄，并提供了關(guān)于這種子宮內(nèi)膜液中天然肽含量的大量新信息。

案例二：Quantitative Proteomic Analysis of Chikungunya Virus-Infected Aedes aegypti Reveals Proteome Modulations Indicative of Persistent Infection
摘要：蚊子傳播的奇昆古尼亞病毒（CHIKV）對全世界熱帶國家的人類健康構(gòu)成威脅。2020年美國密蘇里大學的研究團隊利用高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組學技術(shù)對感染和未感染的CHIKV的埃及伊蚊樣本中鑒定出2647至3167種蛋白質(zhì)，揭示了蚊子體內(nèi)與CHIKV相互作用的生物途徑和新蛋白質(zhì)�？偟膩碚f，CHIKV感染引起蚊子蛋白質(zhì)組的微小變化，表明載體和病毒之間高度適應(yīng)，基本上以非致病關(guān)系共存。

案例三：In-depth proteomic analysis of Plasmodium berghei sporozoites using trapped ion mobility spectrometry with parallel accumulation-serial fragmentation
摘要：2021年法國索邦大學研究團隊利用高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組學技術(shù)，結(jié)合三種不同的子孢子純化方法，利用少量寄生蟲鑒定伯氏瘧原蟲子孢子的蛋白質(zhì)組。這項研究為伯氏瘧原蟲子孢子提供了一個參考蛋白質(zhì)組，確定了一組跨物種表達的核心蛋白質(zhì)，并說明了timsTOF PRO系統(tǒng)前所未有的靈敏度如何能夠從有限的樣本量進行深度蛋白質(zhì)組分析。

案例四：Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis
摘要：2021年，美國普渡大學研究團隊基于新優(yōu)化的分離方法——BiMBs方法，能夠高效地從尿液中分離出細胞外囊泡，該方法具有低污染、高回收率以及分離時間短等優(yōu)點。同時，結(jié)合高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組和4D label free磷酸化蛋白質(zhì)組等新技術(shù)對前列腺癌患者和健康個體尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)，表明其在臨床研究中的巨大應(yīng)用潛力。

案例五：Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro
摘要：2021年美國威斯康星大學麥迪遜分校的研究團隊開發(fā)了一種超快速自下而上的4D label free蛋白質(zhì)組學技術(shù)方法，該方法由Azo（偶氮,一種可光裂解的、與質(zhì)譜兼容的表面活性劑，可有效溶解蛋白質(zhì)并促進快速胰蛋白酶消化）與Bruker timsTOF Pro相結(jié)合，通過捕獲離子遷移譜（TIMS）和肽的平行積累-串聯(lián)片段化（PASEF）實現(xiàn)更深的蛋白質(zhì)組覆蓋。應(yīng)用這種方法來分析復雜的人類心臟蛋白質(zhì)組，從少至1毫克的人類心臟組織中鑒定了近4000個蛋白質(zhì)組，具有高重現(xiàn)性�？偟膩碚f，作者預(yù)計這種由Azo和timsTOF Pro支持的超快速、穩(wěn)健和可重復的自下而上方法將普遍適用，并大大加快大規(guī)模定量蛋白質(zhì)組學研究的吞吐量。

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