CAR-T細胞療法在實體瘤研究中面臨的挑戰(zhàn)

圖1.  CAR-T細胞療法的局限性^[1]。A. 抗原逃逸；B. 脫靶效應(yīng)；C. CAR-T細胞轉(zhuǎn)運及浸潤；D. 免疫抑制微環(huán)境；E. CAR-T細胞相關(guān)的毒性。

CAR分子結(jié)構(gòu)
CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞的原理是：1.CAR分子的胞外抗原結(jié)合域特異性識別腫瘤抗原；2.識別信號傳導(dǎo)至CAR分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；3.胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域活化T細胞，使細胞增殖、合成穿孔素和顆粒酶、釋放細胞因子等，殺傷腫瘤細胞。為了最大程度地發(fā)揮以上功能，CAR分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計是至關(guān)重要的。

CAR分子由4個主要成分構(gòu)成：
1. 細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域：賦予CAR分子靶點特異性的功能。它的原理是將抗體的可變重鏈（V_H）和可變輕鏈（V_L）連接形成單鏈可變區(qū)段（scFv），用以特異性識別腫瘤表面抗原。

2. 鉸鏈區(qū)：連接跨膜域和細胞外單元的結(jié)構(gòu)區(qū)。鉸鏈的作用是提供空間靈活性，可以克服空間位阻，并且擁有合適的長度允許抗原結(jié)合域接近目標(biāo)表位^[1]。

3. 跨膜結(jié)構(gòu)域：主要功能是將CAR分子錨定在T細胞的細胞膜上。有研究表明，跨膜區(qū)可能影響CAR分子的表達水平、穩(wěn)定性，在信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用^[2][3][4]。

4. 細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：CAR分子共刺激的效果是CAR工程中備受關(guān)注的焦點。1-3代CAR分子的主要區(qū)別來自于胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域。兩種最常見的、經(jīng)由FDA批準(zhǔn)的共刺激域CD28和4-1BB都具有高效的活化T細胞的效果，可誘導(dǎo)T細胞執(zhí)行不同的功能^[5]。
 

圖2. CAR分子設(shè)計藍圖^[20]。

CAR-T細胞治療實體瘤的挑戰(zhàn)
1●腫瘤抗原異質(zhì)性
腫瘤抗原異質(zhì)性是CAR-T細胞療法對抗實體瘤的障礙之一。腫瘤抗原主要分為兩種：腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和腫瘤特異性抗原（TSA）：TAA在腫瘤細胞中高表達，在正常組織細胞中也有表達，但表達量較低；TSA僅在腫瘤細胞中表達，不在正常組織細胞中表達，因此也是最理想的抗原靶點。由于TSA的發(fā)現(xiàn)和篩選極為困難，CAR分子最常用的識別靶點是TAA，因此不同類型腫瘤細胞對于TAA的多樣性表達可能會影響CAR-T細胞對癌細胞的識別，并降低CAR-T治療的效果。

目前已經(jīng)有多種方法使CAR-T細胞靶向識別多種腫瘤相關(guān)抗原，例如在單一的T細胞上共表達多種CAR分子、可編程式的CAR表達調(diào)控等。表達兩個或多個抗原識別結(jié)構(gòu)域，可以使單個CAR-T細胞識別腫瘤細胞上表達的多個抗原，從而消除抗原異質(zhì)性帶來的不利影響。
 

圖3. 實體瘤中的免疫抑制微環(huán)境^[13]。a. 效應(yīng)細胞和靶細胞；b. 免疫抑制細胞和細胞因子；c. 物理屏障；d. 腫瘤內(nèi)部微環(huán)境；e. 其他免疫抑制因素

2●CAR-T細胞的回輸和對腫瘤組織的浸潤
CAR-T細胞可以存在于血液和淋巴系統(tǒng)中，因此對于血液瘤，CAR-T細胞具有更多的機會和血液腫瘤細胞接觸^[1]，而在實體瘤中，CAR-T細胞較難通過血液系統(tǒng)穿透腫瘤組織^[6]。此外，由于缺乏參與T細胞滲透到腫瘤組織中的趨化因子表達，以及實體瘤中存在致密的纖維化基質(zhì)，導(dǎo)致CAR-T細胞遷移和侵入腫瘤細胞的能力降低^[7]。

在很多報道中已有將CAR-T細胞直接局部注入到腫瘤位點（Tumor site）中的方法，比如腦部^[8]、乳腺^[9]、胸膜^[10]、肝臟等^[11]。CAR-T細胞的局部注射也可能降低脫靶效應(yīng)帶來的風(fēng)險。然而，許多實體瘤具有轉(zhuǎn)移性，是局部注射CAR-T細胞的一大難點。另一方面，一些臨床研究中使用趨化因子介導(dǎo)CAR-T細胞的運輸，增強對腫瘤的定位。例如巨噬細胞集落刺激因子1受體 (CSF-1R) 在CAR-T 細胞中的表達使這些細胞對CSF-1（一種在許多實體瘤中富集的單核細胞趨化因子）產(chǎn)生反應(yīng)，在增強CAR-T細胞增殖信號傳導(dǎo)的同時，不影響細胞的殺傷毒性^[12]。

實體瘤的腫瘤微環(huán)境在促進腫瘤生長和增殖的同時，對CAR-T細胞造成了免疫抑制。包括免疫抑制細胞如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、髓源抑制細胞（MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）^[13]，實體瘤中產(chǎn)生的生長因子、局部細胞因子，CTLA-4和PD-1等免疫檢查點分子等，這些復(fù)合環(huán)境下的腫瘤微環(huán)境會極大地限制CAR-T細胞的療效。

在Burga等人的研究中^[14]，使用基因工程產(chǎn)生的Gr-1抗體耗竭髓源抑制細胞（MDSC）在小鼠實驗中提高了CAR-T的腫瘤殺傷效果。也有報道通過構(gòu)建分泌ECM降解酶的CAR-T細胞來打破實體瘤中的物理屏障^[15]。

CAR-T細胞治療實體瘤的進展
近年來，針對實體瘤靶點的研究開始逐漸增多，已有相當(dāng)一部分的研究進入到了臨床Ⅱ期階段。表1列舉了一些常見的實體瘤靶點以及適應(yīng)癥。

表1. 實體瘤常見靶點及適應(yīng)癥（臨床數(shù)據(jù)來源于ClinicalTrails.org）。

已有報道稱，卵巢癌表面高表達的腫瘤相關(guān)糖蛋白72（TAG72）被用作 CAR-T 細胞治療的靶點^[16]。該研究構(gòu)建了第二代TAG72-BBζ CAR分子，結(jié)果顯示CAR-T細胞經(jīng)局部腹膜內(nèi)遞送表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性，并延長了卵巢癌腹水小鼠的生存期。也有研究表明使用MUC16或HER2構(gòu)建的CAR分子具有腫瘤靶向性，抑制卵巢癌細胞的生長和增殖。間皮素（Mesothelin）是一種細胞表面糖蛋白，已被證明在多種癌癥細胞中高表達。

在肝癌治療中，CAR-T細胞療法的研究剛剛起步�；�于CAR-T細胞的癌胚抗原（CEA）、Glypican-3、粘蛋白-1等靶點的研究已經(jīng)在肝癌治療中取得了一定的效果。將 Glypican-3 (GPC3) 抗體與CAR-T療法聯(lián)合使用可能是治療肝臟惡性腫瘤的有效方法^[21]。

在肺癌的研究中，用受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1特異性(ROR1)-CAR-T細胞治療肺癌A549細胞系，表明其具有較強的抗腫瘤活性^[18]。而Srivastava及其同事在發(fā)現(xiàn)ROR1 CAR-T細胞浸潤性較差并且功能性失調(diào)后，使用奧沙利鉑/環(huán)磷酰胺（Ox/Cy ）化療預(yù)處理，改善了CAR-T細胞向腫瘤的遷移，并且這種方案配合抗PD-L1檢查點阻斷劑，可以提高生存率^[19]。此外，也有其他報道證實基于CAR-T細胞的間皮素 、產(chǎn)生促紅細胞生成素的肝細胞癌A2(EphA2)，以及PSCA和mucin-1也是肺癌的理想治療靶點。
 

圖5. 聯(lián)合Ox/Cy 化療預(yù)處理的CAR-T細胞療法^[19]。

CAR-T細胞療法為血液瘤患者帶來了希望，尤其是在晚期惡性腫瘤中，擁有不錯的前景。然而，腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、物理屏障、抗原異質(zhì)性等因素阻礙了CAR-T細胞在實體瘤中的療效，還有待進一步突破性進展。研究者們?yōu)榱藨?yīng)對這些挑戰(zhàn)已經(jīng)做了很多準(zhǔn)備和具有前瞻性的工作。新穎的想法和創(chuàng)造性的CAR工程設(shè)計不斷迭代與更新，我們也期待著針對實體瘤CAR-T治療的完美解決方案。

賽業(yè)生物基于多年在腫瘤免疫領(lǐng)域的研究經(jīng)驗，可為CAR-T及其它細胞治療研究者提供從CAR病毒制備、腫瘤免疫細胞與動物模型的構(gòu)建，到體內(nèi)體外藥效評價的全流程服務(wù)，更好地加速CAR-T及細胞治療研發(fā)進程。

針對CAR-T及細胞治療研究，賽業(yè)生物建立了豐富的供腫瘤免疫研究的小鼠模型庫，可根據(jù)您的需求提供多種有效的CDX模型、免疫缺陷小鼠、免疫系統(tǒng)人源化小鼠、同源腫瘤小鼠模型等評價模型。我們還可以構(gòu)建各類皮下、原位或者轉(zhuǎn)移瘤模型，并針對相應(yīng)的模型提供高度定制化的體內(nèi)藥效學(xué)服務(wù)，以滿足您的全方位需求。如有需要，歡迎后臺留言或聯(lián)系我們咨詢~

參考文獻：
[1]Sterner, R. C., & Sterner, R. M. (2021). CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal, 11(4), 1-11.

[2]Bridgeman, J. S., Hawkins, R. E., Bagley, S., Blaylock, M., Holland, M., & Gilham, D. E. (2010). The optimal antigen response of chimeric antigen receptors harboring the CD3ζ transmembrane domain is dependent upon incorporation of the receptor into the endogenous TCR/CD3 complex. The Journal of Immunology, 184(12), 6938-6949.

[3]Guedan, S., Posey Jr, A. D., Shaw, C., Wing, A., Da, T., Patel, P. R., ... & June, C. H. (2018). Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI insight, 3(1).

[4]Zhang, T., Wu, M. R., & Sentman, C. L. (2012). An NKp30-based chimeric antigen receptor promotes T cell effector functions and antitumor efficacy in vivo. The Journal of Immunology, 189(5), 2290-2299.

[5]Kawalekar, O. U., O’Connor, R. S., Fraietta, J. A., Guo, L., McGettigan, S. E., Posey Jr, A. D., ... & June, C. H. (2016). Distinct signaling of coreceptors regulates specific metabolism pathways and impacts memory development in CAR T cells. Immunity, 44(2), 380-390.

[6]Salmon, H., Franciszkiewicz, K., Damotte, D., Dieu-Nosjean, M. C., Validire, P., Trautmann, A., ... & Donnadieu, E. (2012). Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors. The Journal of clinical investigation, 122(3), 899-910.

[7]Li, J., Li, W., Huang, K., Zhang, Y., Kupfer, G., & Zhao, Q. (2018). Chimeric antigen receptor T cell (CAR-T) immunotherapy for solid tumors: lessons learned and strategies for moving forward. Journal of hematology & oncology, 11(1), 1-18.

[8]Brown, C. E., Alizadeh, D., Starr, R., Weng, L., Wagner, J. R., Naranjo, A., ... & Badie, B. (2016). Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-cell therapy. New England Journal of Medicine, 375(26), 2561-2569.

[9]Tchou, J., Zhao, Y., Levine, B. L., Zhang, P. J., Davis, M. M., Melenhorst, J. J., ... & June, C. H. (2017). Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (CAR) T cells in metastatic breast cancer. Cancer immunology research, 5(12), 1152-1161.

[10]G. L., Haas, A. R., Maus, M. V., Torigian, D. A., Soulen, M. C., Plesa, G., ... & June, C. H. (2014). Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mRNA-engineered T cells induce antitumor activity in solid malignancies. Cancer immunology research, 2(2), 112-120.

[11]Hardaway, J. C., Prince, E., Arepally, A., & Katz, S. C. (2018). Regional infusion of chimeric antigen receptor T cells to overcome barriers for solid tumor immunotherapy. Journal of vascular and interventional radiology: JVIR, 29(7), 1017-1021.

[12]Lo, A. S. Y., Taylor, J. R., Farzaneh, F., Kemeny, D. M., Dibb, N. J., & Maher, J. (2008). Harnessing the tumour-derived cytokine, CSF-1, to co-stimulate T-cell growth and activation. Molecular immunology, 45(5), 1276-1287.

[13]Zhang, E., Gu, J., & Xu, H. (2018). Prospects for chimeric antigen receptor-modified T cell therapy for solid tumors. Molecular cancer, 17(1), 1-12.

[14]Burga, R. A., Thorn, M., Point, G. R., Guha, P., Nguyen, C. T., Licata, L. A., ... & Katz, S. C. (2015). Liver myeloid-derived suppressor cells expand in response to liver metastases in mice and inhibit the anti-tumor efficacy of anti-CEA CAR-T. Cancer Immunology, Immunotherapy, 64(7), 817-829.

[15]Caruana, I., Savoldo, B., Hoyos, V., Weber, G., Liu, H., Kim, E. S., ... & Dotti, G. (2015). Heparanase promotes tumor infiltration and antitumor activity of CAR-redirected T lymphocytes. Nature medicine, 21(5), 524-529.

[16]Murad, J. P., Kozlowska, A. K., Lee, H. J., Ramamurthy, M., Chang, W. C., Yazaki, P., ... & Priceman, S. J. (2018). Effective targeting of TAG72+ peritoneal ovarian tumors via regional delivery of CAR-engineered T cells. Frontiers in immunology, 9, 2268.

[17]Cao, B., Liu, M., Wang, L., Liang, B., Feng, Y., Chen, X., ... & Zhang, Z. (2020). Use of chimeric antigen receptor NK-92 cells to target mesothelin in ovarian cancer. Biochemical and biophysical research communications, 524(1), 96-102.

[18]Wallstabe, L., Göttlich, C., Nelke, L. C., Kühnemundt, J., Schwarz, T., Nerreter, T., ... & Hudecek, M. (2019). ROR1-CAR T cells are effective against lung and breast cancer in advanced microphysiologic 3D tumor models. JCI insight, 4(18).

[19]Srivastava, S., Furlan, S. N., Jaeger-Ruckstuhl, C. A., Sarvothama, M., Berger, C., Smythe, K. S., ... & Riddell, S. R. (2021). Immunogenic chemotherapy enhances recruitment of CAR-T cells to lung tumors and improves antitumor efficacy when combined with checkpoint blockade. Cancer Cell, 39(2), 193-208.

[20]Rafiq, S., Hackett, C. S., & Brentjens, R. J. (2020). Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nature reviews Clinical oncology, 17(3), 147-167.

[21]Marofi, F., Motavalli, R., Safonov, V. A., Thangavelu, L., Yumashev, A. V., Alexander, M., ... & Khiavi, F. M. (2021). CAR T cells in solid tumors: challenges and opportunities. Stem cell research & therapy, 12(1), 1-16.