空間基因表達(dá)+T細(xì)胞受體測序探索腦轉(zhuǎn)移瘤微環(huán)境中的免疫活動

「轉(zhuǎn)移」二字對于任何一個癌癥病人來說都是最不想聽到的壞消息之一。那么醫(yī)生口中的轉(zhuǎn)移究竟是什么呢？醫(yī)學(xué)上是這樣定義的：當(dāng)癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散到身體的其他部位，在之前未接觸過的器官中沉積癌細(xì)胞群，在那里不受控制的細(xì)胞生長繼續(xù)造成傷害。當(dāng)治療無法控制癌癥發(fā)展時，不論在身體還是精神上，患者及其家屬都將面臨更嚴(yán)峻的考驗(yàn)。

// 為什么T細(xì)胞浸潤在轉(zhuǎn)移瘤中尤為重要？

在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中，預(yù)后高度依賴于腫瘤微環(huán)境中的免疫活性。Barnes和Amir在英國癌癥雜志上指出：“‘促炎性’腫瘤微環(huán)境和浸潤的CD8表達(dá)淋巴細(xì)胞與多種腫瘤類型的臨床結(jié)果改善有關(guān)”^[1]。在轉(zhuǎn)移瘤中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，有研究分析了25對原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）標(biāo)本和腦轉(zhuǎn)移瘤NSCLC，發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移灶實(shí)質(zhì)CD8⁺T細(xì)胞的總體密度高于原發(fā)灶，且基質(zhì)中CD8⁺TIL數(shù)量較少的患者預(yù)后較差，該研究指出“腦轉(zhuǎn)移瘤中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 (TIL) 與預(yù)后呈正相關(guān)^[2]。

腦轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)涉及四個主要步驟^[2]：1.轉(zhuǎn)移細(xì)胞從原發(fā)癌中脫離，

2.在體循環(huán)中存活，3.在腦實(shí)質(zhì)中的侵襲，以及4.在中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中的存活。

但是，正如Barnes和Amir所言，并非所有T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中都具有相同的積極作用。“其他免疫細(xì)胞的抑制功能，例如髓源性抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Tregs)，似乎在破壞癌癥免疫控制能力方面發(fā)揮著重要作用，從而產(chǎn)生更糟糕的結(jié)果”^[1]。也有其他發(fā)現(xiàn)指出癌癥進(jìn)化和治療耐藥性的模型取決于腫瘤免疫浸潤的組成。邁阿密大學(xué)綜合癌癥中心的科學(xué)家們使用單細(xì)胞測序研究葡萄膜黑色素瘤 (UM) 的腫瘤微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)了在以往研究中未曾與UM聯(lián)系起來的特定免疫細(xì)胞群。這包括具有替代檢查點(diǎn)標(biāo)記LAG3的T細(xì)胞，其在UM腫瘤中的表達(dá)比傳統(tǒng)的CTLA4和PD1標(biāo)記更廣泛^[3]。

因此，區(qū)分腫瘤微環(huán)境 (TME) 中的T細(xì)胞功能狀態(tài)、抗原特異性和其他總體特征對于了解癌癥預(yù)后至關(guān)重要，這也解釋了為什么某些癌癥對治療和轉(zhuǎn)移沒有反應(yīng)。但是TIL的分子特征只是一方面，畢竟每種癌癥類型甚至每種特定的腫瘤都具有獨(dú)特的特性，可以影響免疫微環(huán)境的組成和空間組織。換句話說，腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤的程度也會影響預(yù)后。

在一項(xiàng)三陰性乳腺癌研究中，Visium空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示在組織切片中，腫瘤塊周圍有一圈耗盡的T細(xì)胞^[4]�？臻g分辨的基因表達(dá)可以提供比單獨(dú)的病理學(xué)注釋更高分辨率的浸潤免疫細(xì)胞的鑒定和滲透到癌組織程度的可視化視圖。結(jié)果表明浸潤的T細(xì)胞群具有的抗腫瘤功效有限。

（a）三陰性乳腺癌樣本的病理學(xué)注釋。

（b）利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)，推測每個Visium斑點(diǎn)的基因型為腫瘤或正常。還顯示了重疊的病理學(xué)注釋。

（c）特定T細(xì)胞亞型浸潤區(qū)域，通過結(jié)合Visium空間基因表達(dá)和單核RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

在致瘤區(qū)域周圍可以看到耗盡的T細(xì)胞。

// 空間基因表達(dá)和T細(xì)胞受體測序的結(jié)合研究

這些在對癌癥的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用的復(fù)雜因素表明，需要對TME進(jìn)行全面的了解以統(tǒng)一多維讀數(shù)，包括T細(xì)胞組成和浸潤的單細(xì)胞和空間注釋。William等人在一項(xiàng)研究中通過Visium空間基因表達(dá)技術(shù)定義T細(xì)胞受體 (TCR) 序列，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞受體序列“決定了淋巴細(xì)胞抗原的特異性，并且可以作為淋巴細(xì)胞克隆的條形碼”，這是T細(xì)胞識別和功能鑒定的關(guān)鍵讀數(shù)。通過這種方式，可以實(shí)現(xiàn)在一次測定中同時顯示組織樣本中的T細(xì)胞受體克隆型和整體基因表達(dá)^[5]。

為此，研究人員修改了在Visium分析中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫制備步驟。他們將引物添加到TCR序列的5'端，以同時捕獲TCR的可變CDR3區(qū)域和包含組織切片內(nèi)轉(zhuǎn)錄物位置信息的空間條形碼。此外還修改了文庫清理步驟，標(biāo)準(zhǔn)Visium分析需要對cDNA文庫進(jìn)行片段化，但在這種情況下，他們通過珠子純化來清理文庫，以保留TCR和空間條形碼序列之間的聯(lián)系^[5]。

 // 多個角度探索腦轉(zhuǎn)移瘤中的T細(xì)胞浸潤

利用這種方法從空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中獲取TCR序列，研究團(tuán)隊對31例腦轉(zhuǎn)移患者手術(shù)切除后的浸潤性CD8⁺ T細(xì)胞及其周圍腫瘤微環(huán)境進(jìn)行了詳細(xì)的表征。他們在PD1⁺ CD8⁺ T細(xì)胞中確定了四個主要的轉(zhuǎn)錄群體，包括分裂細(xì)胞、終分化細(xì)胞和兩個與耗盡的祖細(xì)胞特征相似的簇。TCR序列的空間解析讀取和基因表達(dá)也顯示，每個群體都定位于腦轉(zhuǎn)移瘤微環(huán)境的特定區(qū)域，這表明CD8⁺ 腫瘤浸潤T細(xì)胞根據(jù)抗原特異性排列^[6]。

除了能夠指導(dǎo)潛在的腦轉(zhuǎn)移免疫治療策略外，這些發(fā)現(xiàn)還體現(xiàn)了生物學(xué)系統(tǒng)方法的價值，即建立在多組生物學(xué)觀點(diǎn)之上，通過從多個參數(shù)獲得的信息來揭示細(xì)胞異質(zhì)性。通過將T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征、空間定位和TCR抗原特異性結(jié)合在一起，構(gòu)建了對適應(yīng)性免疫過程的最全面的理解。有了這些分析物，科學(xué)家們可以繼續(xù)在解決腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜的免疫活動和驅(qū)動癌癥預(yù)后的多維因素方面深入探索。

參考文獻(xiàn)：

• [1]Barnes T and Amir E. HYPE or HOPE: the prognostic value of infiltrating immune cells in cancer. BJC 117: 451–460 (2017). doi: 10.1038/bjc.2017.220

• [2]Luo L, et al.The Immune microenvironment in brain metastases of non-small cell lung cancer. Front Oncol 11: 698844 (2021). doi: 10.3389/fonc.2021.698844

• [3]GenomeWeb and 10x Genomics. White Paper. Using Single-Cell Multiomics to Reveal New Insights Into Uveal Melanoma Evolution and Therapeutic Resistance. 

• [4]10x Genomics. Application Note. Spatially Resolved Heterogeneity of Triple Negative Breast Cancer. 

• [5]Hudson W and Sudmeier L. Localization of T cell clonotypes using spatial transcriptomics. bioRxiv. Posted August 5, 2021. doi: 10.1101/2021.08.03.454999

• [6]Sudmeier L, et al. The CD8⁺T cell landscape of human brain metastases. bioRxiv. Posted August 5, 2021. doi: 10.1101/2021.08.03.455000