單細(xì)胞ATAC-seq幫助科學(xué)家通過(guò)克隆譜系追蹤來(lái)評(píng)估腫瘤克隆異質(zhì)性

本期推送帶來(lái)了斯坦福大學(xué)的Caleb Lareau博士在去年八月的全球虛擬癌癥研討會(huì)上分享的線粒體單細(xì)胞ATAC-seq (mtscATAC-seq) 的技術(shù)。該技術(shù)幫助Lareau博士通過(guò)克隆譜系追蹤來(lái)評(píng)估驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展、進(jìn)化和轉(zhuǎn)移的主要因素——腫瘤克隆異質(zhì)性。

通過(guò)線粒體DNA了解腫瘤發(fā)生

“腫瘤形成在時(shí)空上是不連續(xù)的；是一個(gè)通過(guò)不同階段不斷推進(jìn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。”^[1]

1958年，英國(guó)癌癥研究學(xué)院的Leslie Foulds博士提出了上面這樣的觀點(diǎn)，并建立了一種新的腫瘤發(fā)生模型。在該模型中，癌癥不像以前推測(cè)的那樣以規(guī)律的線性方式發(fā)展。相反，癌癥起源于更復(fù)雜、更分散的路徑^[2]。時(shí)間來(lái)到20世紀(jì)70年代，研究人員又提出了一種由基因組不穩(wěn)定性驅(qū)動(dòng)的癌癥進(jìn)展的演化模型，從而導(dǎo)致異質(zhì)性癌細(xì)胞從克隆起源分支出來(lái)^[2]。

由基因突變驅(qū)動(dòng)的腫瘤演化標(biāo)準(zhǔn)模型

圖片來(lái)源：Darryl Leja, NHGRI

而現(xiàn)在，這種異質(zhì)性被認(rèn)為在腫瘤進(jìn)展、對(duì)治療的不同反應(yīng)和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)Caswell和Swanton的說(shuō)法，“深入了解單個(gè)腫瘤的克隆復(fù)雜性及其對(duì)腫瘤進(jìn)展、免疫逃逸和衰竭的貢獻(xiàn)，可能對(duì)開(kāi)發(fā)更有效的癌癥治療方法至關(guān)重要”^[2]。

但是，當(dāng)變化的特征難以識(shí)別時(shí)，理解驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展的細(xì)胞間變化就十分具有挑戰(zhàn)了。研究人員利用基因突變來(lái)跟蹤從最初的克隆到腫瘤生成的路徑，包括拷貝數(shù)變異 (CNVs) 和單核苷酸變異 (SNVs) 。然而，Lareau博士在全球虛擬癌癥研討會(huì)上指出，這種方法在處理沒(méi)有大量可檢測(cè)的CNVs或SNVs的腫瘤時(shí)會(huì)失效。也正是這一挑戰(zhàn)促使他的團(tuán)隊(duì)尋求其他方法來(lái)解構(gòu)克隆譜系并揭示了腫瘤中的混合細(xì)胞群。

研究人員將體細(xì)胞線粒體DNA (mtDNA) 作為追蹤腫瘤細(xì)胞克隆譜系的有效生物學(xué)參數(shù)。mtDNA在細(xì)胞分裂的每個(gè)周期中被傳遞給子細(xì)胞，并且被嚴(yán)重誘變，突變率是核基因組的10到100倍。因?yàn)槊總�(gè)細(xì)胞中有成百上千個(gè)mtDNA拷貝，所以確定的突變具有很高的可信度。這使得mtDNA在追蹤細(xì)胞系中的體細(xì)胞突變方面非常具有價(jià)值。并且從實(shí)驗(yàn)的角度來(lái)看，mtDNA也很容易獲得。此外，由于每個(gè)分子比核基因組小20萬(wàn)倍，對(duì)mtDNA進(jìn)行測(cè)序的成本也不高。

Lareau博士還指出了使用mtDNA的另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：它可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的染色質(zhì)可及性實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行測(cè)量。

“在ATAC-seq中，多達(dá)一半的讀取將歸因于線粒體DNA。這是因?yàn)榫�粒體DNA沒(méi)有核小體或組蛋白，所以整個(gè)16.6kb的重疊群本質(zhì)上是存在于細(xì)胞質(zhì)中，在線粒體中，Tn5[轉(zhuǎn)座酶]可以對(duì)其進(jìn)行切割。這通常被認(rèn)為是ATAC-seq中令人討厭的一部分，但對(duì)于對(duì)測(cè)序線粒體DNA以創(chuàng)造深度感興趣的人來(lái)說(shuō)，這卻是一個(gè)兩全其美的方法，使用標(biāo)準(zhǔn)的ATAC-seq可以對(duì)線粒體DNA和可及性染色質(zhì)進(jìn)行非常深入的測(cè)序，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞突變的評(píng)估以及推斷細(xì)胞狀態(tài)的特性。”

Lareau博士解釋說(shuō)，憑借進(jìn)行深度線粒體測(cè)序的能力，甚至可以檢測(cè)到低頻體細(xì)胞突變，這可能揭示克隆進(jìn)化的隱藏驅(qū)動(dòng)因素或?qū)е庐愘|(zhì)性的少量不同腫瘤細(xì)胞。

單細(xì)胞ATAC-seq的樣本準(zhǔn)備

因?yàn)樵谡劦侥[瘤異質(zhì)性時(shí)每個(gè)細(xì)胞都很重要，所以線粒體DNA的單細(xì)胞視圖對(duì)于Lareau博士的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。因此他的團(tuán)隊(duì)選擇進(jìn)行10x Genomics Chromium Single Cell ATAC-seq測(cè)定，然而ATAC-seq需要單核作為樣本輸入，這意味著線粒體的丟失。

于是Lareau博士接下來(lái)的一個(gè)挑戰(zhàn)就是開(kāi)發(fā)一種方法，從而可以在基于液滴的單細(xì)胞ATAC-seq反應(yīng)中保留細(xì)胞質(zhì)及其內(nèi)容物。樣品制備和數(shù)據(jù)處理中的三項(xiàng)關(guān)鍵創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)了這一設(shè)想。他們采用了一種改良的細(xì)胞裂解方案以保留mtDNA，增加了一個(gè)額外的固定步驟，并開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的計(jì)算框架來(lái)調(diào)用變體，包括頻率較低的變體。這些創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞分辨率下對(duì)整個(gè)線粒體染色體的幾乎無(wú)偏的覆蓋，從而獲得更高的細(xì)胞通量和性能。

線粒體DNA --圖片來(lái)源：NHGRI

當(dāng)應(yīng)用于慢性淋巴細(xì)胞白血病樣本時(shí)，這種方法的優(yōu)勢(shì)也很明顯。白血病患者外周血中的B細(xì)胞數(shù)量較多，這些B細(xì)胞通常共享一個(gè)主要的B細(xì)胞受體 (BCR) 序列。這是克隆擴(kuò)張的標(biāo)志，意味著組成腫瘤的大多數(shù)B細(xì)胞都是設(shè)定受體序列的初始克隆的子細(xì)胞。然而，Lareau博士想知道是否能在這些看似同質(zhì)的B細(xì)胞中找到獨(dú)特的亞克隆群。

對(duì)于一半的白血病樣本，他們使用10xGenomics的5'單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)來(lái)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)和BCR序列。對(duì)于剩下的一半樣本，他們利用改良的mtscATAC-seq實(shí)驗(yàn)方案來(lái)識(shí)別亞克隆線粒體DNA突變。特別是有一名患者，有十幾個(gè)體細(xì)胞突變，使他們能夠?qū)�B細(xì)胞聚集成9個(gè)獨(dú)特的亞克隆。

“在發(fā)現(xiàn)這些突變后，我們有點(diǎn)想知道，這些被這些突變標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞是否有任何功能價(jià)值？”

仔細(xì)觀察他們對(duì)BCR序列和mtDNA突變進(jìn)行測(cè)序的一組細(xì)胞，他們改進(jìn)了潛在的亞克隆群體。雖然一些攜帶線粒體突變的亞克隆與大多數(shù)腫瘤具有相同的BCR序列，但一小群B細(xì)胞在14858G等位基因處共享一個(gè)突變并具有不同的BCR序列。

“這提供了一些全面的佐證，即DNA突變正在標(biāo)記某種真正的、功能性的亞克隆，該亞克隆與腫瘤的其余部分具有非常不同的BCR序列。”

mtscATAC-seq解鎖更大的多組學(xué)潛力

mtscATAC-seq提供了定義腫瘤中獨(dú)特亞克隆的潛在生物學(xué)的高分辨率視圖，通過(guò)解鎖隱藏的腫瘤異質(zhì)性，mtscac-seq有可能幫助科學(xué)家建立更全面的癌癥知識(shí)。而這僅僅是個(gè)開(kāi)始。新一代多組學(xué)的持續(xù)創(chuàng)新，即從同一單個(gè)細(xì)胞或組織切片同時(shí)捕獲多個(gè)測(cè)量值，正在打開(kāi)新的大門(mén)，使得科學(xué)家在同一實(shí)驗(yàn)中能夠獲得更多的分析數(shù)據(jù)。Lareau博士和該領(lǐng)域的其他領(lǐng)軍人物，前紐約基因組中心的Eleni Mimitou和Peter Smibert共同開(kāi)發(fā)了ASAP-seq（ATAC 與 Select Antigen Profiling bySequencing）。利用mtscATAC-seq所展示的方法改良，即增加額外的細(xì)胞固定步驟以保持蛋白質(zhì)表達(dá)，ASAP-seq使科學(xué)家能夠“收集染色質(zhì)可及性、數(shù)百種細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的豐度以及數(shù)千種細(xì)胞的mtDNA變體的信息。”^[3]。不久之后，該團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了DOGMA-seq，它利用來(lái)自10x Genomics的Chromium Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression從同一細(xì)胞中捕獲更多信息層，即RNA。

參考文獻(xiàn)：

[1]Foulds L. The natural history of cancer. J Chronic Dis 8: 2–37 (1958).

[2]Caswell DR and Swanton C. The role of tumour heterogeneity and clonal cooperativity in metastasis, immune evasion and clinical outcome. BMC Med 15: 133 (2017).

[3]Tang L, et al. Arsenal of single-cell multi-omics methods expanded. Nat Methods 18: 858 (2021).