單細(xì)胞+timsTOF揭示傷口再生的動(dòng)態(tài)圖譜

再生是組織修復(fù)的“必殺技”，但皮膚損傷通常會(huì)產(chǎn)生纖維化的、無(wú)功能的疤痕。疤痕是指皮膚損傷后的纖維化，通過(guò)用非功能性結(jié)締組織替代功能性組織來(lái)確保傷口能夠盡快愈合。由于疤痕沒(méi)有皮膚的毛發(fā)或腺體，因此也不具有正常的體溫調(diào)節(jié)或屏障功能。盡管纖維化帶來(lái)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)巨大，但目前尚無(wú)有效的治療方法，部分原因是缺乏對(duì)再生和纖維化愈合的基本機(jī)制的了解。所以想要發(fā)展促再生療法，需要深刻理解從損傷到纖維化或再生的分子軌跡。

近日，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究組在Cell Stem Cell（IF：24.633）上發(fā)表了一篇題為Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing的文章，該研究以單細(xì)胞多組學(xué)方式（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+蛋白質(zhì)組）描繪了YAP抑制背景下瘢痕與傷口再生的分子軌跡。

研究發(fā)現(xiàn)，使用YAP (Yes-associated protein) 抑制劑可以防止成纖維細(xì)胞纖維化，并產(chǎn)生ENF (En-1-negative fibroblasts) 介導(dǎo)的再生，這一過(guò)程包括真皮附件如毛囊 (HF) 和腺體的恢復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的結(jié)構(gòu)與未發(fā)生損傷皮膚 (UW) 的結(jié)構(gòu)相同以及具有相似的彈性。

 纖維化和再生創(chuàng)傷的多模態(tài)分析

研究分析了7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠創(chuàng)面和皮膚：UW皮膚、術(shù)后第2天（炎癥期）、術(shù)后第7天（成纖維細(xì)胞增殖期）、術(shù)后第10天、術(shù)后第14天（傷口重新上皮化、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)）、術(shù)后第21天和術(shù)后第30天（成纖維細(xì)胞重塑ECM）。采用夾板切除傷口模型，該模型能夠防止皮膚松弛小鼠典型的傷口快速收縮，從而可以對(duì)傷口恢復(fù)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。傷后立即在創(chuàng)面注射YAP抑制劑或?qū)φ站彌_液，對(duì)傷口進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程多模分析。
 
對(duì)照組創(chuàng)面形成明顯的纖維瘢痕，有密集、線性排列的ECM纖維，無(wú)毛囊和腺體；而YAP抑制劑處理后的創(chuàng)面，有毛囊和腺體再生，ECM纖維密度較低，且生長(zhǎng)方向更隨機(jī)。通過(guò)YAP敲除對(duì)該結(jié)果進(jìn)行再次確認(rèn)，抑制劑與對(duì)照組之間處理的差異并非由于抑制劑的脫靶效應(yīng)引起。
 
根據(jù)FACS策略進(jìn)行細(xì)胞分類，分離成纖維細(xì)胞(Lin-) 和其他細(xì)胞 (主要是免疫細(xì)胞；Lin+)。對(duì)一半的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，總計(jì)2986個(gè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在YAP抑制劑處理的創(chuàng)面中輕微增加；然而，對(duì)照組和YAP抑制劑創(chuàng)面的細(xì)胞比例大體相似，這表明YAP、抑制劑可能通過(guò)改變細(xì)胞表型而不是相對(duì)表征（或通過(guò)改變細(xì)胞類型中的亞群表征）來(lái)誘導(dǎo)再生。剩余的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（timsTOF質(zhì)譜分析）。主成分分析發(fā)現(xiàn)Lin-和Lin+蛋白組學(xué)標(biāo)本在不同時(shí)間點(diǎn)上差異很大，而PBS樣本和YAP抑制劑樣本的差異則比較狹窄，這表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以在更廣泛的修復(fù)動(dòng)力學(xué)中捕獲連貫的纖維化變化。

疤痕形成與再生創(chuàng)面修復(fù)的多模態(tài)分析

(B) 創(chuàng)傷愈合隨時(shí)間變化的小鼠配對(duì)多模態(tài)分析實(shí)驗(yàn)策略。

(C) 按細(xì)胞類型（左上）、處理組（右上）、小鼠個(gè)體（左下）和POD（右下）著色的scRNA-seq細(xì)胞的多重投影。

(D) PBS和維替泊芬（YAP抑制劑）處理的傷口按時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞類型比例。

(E) Lin-（成纖維細(xì)胞，上）和Lin+（非成纖維細(xì)胞，下）細(xì)胞。

(F) 頂部，量化294個(gè)ECM參數(shù)的圖像處理和分析管道示意圖輪廓。底部為對(duì)照（左）和椎體芬（右）傷口隨時(shí)間的t-SNE圖。綠色陰影區(qū)域，UW皮膚簇；疊加箭頭，ECM隨時(shí)間演化。

識(shí)別修復(fù)的分子軌跡

因?yàn)槌衫w維細(xì)胞是瘢痕形成的主要驅(qū)動(dòng)因素，研究假設(shè)YAP抑制劑通過(guò)改變成纖維細(xì)胞表型促進(jìn)再生，并將scRNA-seq分析集中在成纖維細(xì)胞上。單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)再生過(guò)程和纖維化過(guò)程并不是相互排斥的，具有促再生活性的細(xì)胞可能存在于瘢痕創(chuàng)面之中，但是在沒(méi)有干預(yù)的情況下（例如YAP抑制劑處理），促纖維化分子的反應(yīng)會(huì)覆蓋再生的活性，并導(dǎo)致纖維化瘢痕表型。

此外，還分析了另外兩種與傷口相關(guān)的細(xì)胞亞群：骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。髓系細(xì)胞假時(shí)間分析顯示，炎癥基因（如Ccl6、Ccl9和Cxcl2）在早期富集，抗原呈遞基因（如H2復(fù)合物）在后期富集。然而，這些基因在PBS和YAP抑制劑細(xì)胞中表達(dá)相似，表明該分析沒(méi)有區(qū)分纖維化和再生愈合。淋巴樣細(xì)胞假時(shí)間分析也沒(méi)有區(qū)分纖維化和再生的傷口，而是分別反映了早期和晚期的NK和B/T細(xì)胞浸潤(rùn)。發(fā)現(xiàn)抑制劑處理與對(duì)照組相比，免疫細(xì)胞的組成并沒(méi)有出現(xiàn)太大的差異。因此，疤痕表型是否產(chǎn)生并非是由于免疫細(xì)胞的差異，其原因可能還是主要集中在成纖維細(xì)胞之中。

使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)。CellChat強(qiáng)調(diào)了再生臂中涉及疤痕 (PBS) 成纖維細(xì)胞和非典型Wnt信號(hào)的促炎信號(hào)（如CXCL和IL6）的增加。這些獨(dú)特的功能富集項(xiàng)，以及該組中較低的Dpp4表達(dá)，暗示了由非瘢痕性ENF設(shè)計(jì)的獨(dú)特的分子愈合軌跡。
 

成纖維細(xì)胞相互作用的CellChat分析

(A)  細(xì)胞群對(duì)間配體-受體相互作用的強(qiáng)度。邊緣寬度與配體-受體對(duì)的數(shù)量成正比。

(B)  如(A)中，按細(xì)胞種群劃分的子集。

(C)  熱圖顯示了基于指定信號(hào)網(wǎng)絡(luò)(ncWNT, noncanonical Wnt)的計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中心性度量的每個(gè)細(xì)胞群的相對(duì)重要性。

(D和E)推斷出的分泌細(xì)胞輸出(D)和輸入(E)通信模式，顯示出推斷出的潛伏模式和細(xì)胞群之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系(左)和信號(hào)通路(右)。

傷口纖維化和再生軌跡標(biāo)記物的研究

基于綜合多模態(tài)分析，試圖驗(yàn)證不同創(chuàng)傷表型中關(guān)鍵基因的相關(guān)性。圖譜中差異表達(dá)的基因指向了Wnt信號(hào)通路，包括Wnt的靶標(biāo)基因、拮抗基因以及一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子Trps1。先前的研究表明Trps1是Wnt信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，且與皮膚腺體的發(fā)育、生長(zhǎng)和增殖相關(guān)。通過(guò)Trps1基因敲除以及過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究確認(rèn)該基因?qū)τ趥�口再生是必要且充分的。支持了ENF介導(dǎo)的愈合（低Dpp4）在YAP抑制（低Ankrd1）的傷口中通過(guò)Wnt激活（高Trps1和Rspo1）實(shí)現(xiàn)HF再生這一發(fā)現(xiàn)。

確定Trps1在再生中的功能意義

鑒于Trps1在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、HF形態(tài)發(fā)生和YAP調(diào)控中的重要性，以及Trps1+成纖維細(xì)胞和HF再生的空間關(guān)系，研究試圖確定Trps1在創(chuàng)面再生中的作用。綜合多模態(tài)分析區(qū)分了兩種修復(fù)軌跡。第一種是EPF介導(dǎo)的 (Dpp4+)，以機(jī)械激活（高核YAP，Ankrd1+，Trps1-）為特征，導(dǎo)致疤痕ECM。二是ENF介導(dǎo) (Dpp4-)，缺乏機(jī)械活化（低核YAP，Ankrd1-，Trps1+），并通過(guò)Wnt激活導(dǎo)致正常ECM和HF的再生。
總結(jié)一下，該研究通過(guò)對(duì)傷口再生進(jìn)行YAP抑制劑處理后的長(zhǎng)時(shí)程多模分析，建立了傷口再生的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及蛋白質(zhì)圖譜，對(duì)研究皮膚傷口再生與纖維化瘢痕形成的阻斷具有重要價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

Mascharak S, Talbott HE, Januszyk M,Griffin M, Chen K, Davitt MF, Demeter J, Henn D, Bonham CA, Foster DS, MooneyN, Cheng R, Jackson PK, Wan DC, Gurtner GC, Longaker MT. Multi-omic analysisreveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing.Cell Stem Cell. 2022 Feb 3;29(2):315-327.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.12.011.Epub 2022 Jan 24. PMID: 35077667.