抗體篩選方法：雜交瘤、噬菌體展示、單個B細(xì)胞抗體篩選技術(shù)的介紹

抗體篩選是開發(fā)單克隆抗體藥物、雙特異抗體藥物、ADC藥物和CAR-T等細(xì)胞治療藥物的必經(jīng)之路。篩選出優(yōu)質(zhì)的候選抗體，能大大提高這些藥物開發(fā)成功的可能性。近年來，我國惡性腫瘤發(fā)病、死亡率逐年上升，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費超過2200億元。而惡性腫瘤是目前抗體藥、CAR-T等細(xì)胞治療藥物治療的最大適應(yīng)，需求巨大。據(jù)統(tǒng)計，2021年我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)總市場規(guī)模已超200億元，2015-2020年平均年增長率超20%。

相比于傳統(tǒng)小分子藥物，抗體藥可作用的靶點種類更多，且出現(xiàn)耐藥性的比例相對更低，另外還可通過提升抗體藥的親和性從而降低藥物毒副作用。自1986年第一個治療性抗體莫羅單抗-CD3（Muromonab-CD3）被批準(zhǔn)上市，到目前為止已經(jīng)有100多個抗體批準(zhǔn)上市。在2018年，全球藥品銷售額Top10中，抗體藥就占據(jù)了8個，包括6個單抗藥物和2個抗體融合蛋白，并且銷售額占比呈上升趨勢。
 

圖1 2018年全球藥品銷售額Top10

針對某個特定靶點開發(fā)創(chuàng)新性抗體藥或CAR-T細(xì)胞治療藥物，第一步是篩選出候選抗體。目前常見的抗體發(fā)現(xiàn)方法包括雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、單個B細(xì)胞抗體篩選技術(shù)等。

一、雜交瘤技術(shù)
1975年，克勒（Kohler）和米爾斯坦（Milstein）將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得了既可產(chǎn)生單克隆抗體又可無限增殖的雜交瘤細(xì)胞。迄今為止，雜交瘤技術(shù)已發(fā)展非常成熟，是目前制備抗體應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，在已批準(zhǔn)上市的治療性抗體中，多數(shù)來自于雜交瘤小鼠。

通過雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體的技術(shù)流程大致為：

(1）選擇合適抗原免疫動物（一般為小鼠）；

(2）分離小鼠脾臟細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合；

(3）篩選雜交瘤細(xì)胞獲得分泌目標(biāo)抗體的陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞；

(4）擴(kuò)大培養(yǎng)陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞；

(5）體外培養(yǎng)或體內(nèi)誘生法獲得大量的單克隆抗體。
 

圖2 雜交瘤技術(shù)制備抗體流程

雜交瘤的整個過程具有一定的復(fù)雜性和技巧性，例如在免疫動物的過程中，通常在注射抗原時使用佐劑，從而避免非特異性的免疫反應(yīng)將抗原快速分解，達(dá)到抗原緩慢釋放并作用免疫系統(tǒng)，最終提高產(chǎn)生親和性較高抗體的效率；再比如，作為單克隆抗體制備過程中最為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)，細(xì)胞融合率直接影響抗體的制備，特別是對于小鼠脾臟的處理，更要十分小心，稍不注意就會影響最終的融合效率。

雜交瘤技術(shù)可確保不同批次制備的抗體質(zhì)量相同，更加易于復(fù)制，是一種高效的抗體制備技術(shù)。但傳統(tǒng)的雜交瘤得到的是鼠源抗體，如不進(jìn)行人源化改造，進(jìn)入人體內(nèi)會產(chǎn)生針對鼠抗的抗體（Human Antimous Antibody，HAMA），HAMA不僅會導(dǎo)致抗體被快速清除，縮短半衰期進(jìn)而影響療效，嚴(yán)重則引發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)，存在安全性風(fēng)險，因此鼠源抗體需經(jīng)過復(fù)雜的人源化改造才可用于臨床上治療。另外，鼠源抗體的可變區(qū)難以與人類抗原交互，誘發(fā)ADCC的效應(yīng)相對弱，因此無法有效殺滅目標(biāo)。

因此近年來，人源抗體越來越受到關(guān)注，并成為未來的發(fā)展方向。根據(jù)人源比例和部位不同可進(jìn)一步為三大類:
(1) 人鼠嵌合單抗：恒定區(qū)來自人類，可變區(qū)來自小鼠（鼠源成分~35%）；
(2) 人源化單抗：恒定區(qū)來自人類，可變區(qū)為人鼠序列結(jié)合（鼠源成分~10%）；
(3) 全人源化單抗：恒定區(qū)及可變區(qū)均來自于人類（鼠源成分0%）。
 

圖3 不同人源抗體的人源化程度

近年來，越來越多的全人源抗體藥物獲批上市，截至目前已經(jīng)有36款全人源抗體獲批上市，例如2021年5月上市的Amivantamab（楊森生物）是一種靶向c-MET/HGFR和EGFR的雙特異性抗體，對于EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌具有良好的治療效果。目前，制備人源抗體常用的技術(shù)有噬菌體展示技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠雜交瘤技術(shù)。

二、噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示技術(shù)（phage display）是由George P. Smith于1985年開發(fā)的一種體外篩選抗體的方法。通過將外源編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，隨子代噬菌體的重新組裝呈現(xiàn)在噬菌體表面，可以保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。再利用噬菌體庫篩選對目標(biāo)抗原有結(jié)合的抗體進(jìn)行多輪的篩選，并且在大腸桿菌中擴(kuò)大，該過程也被稱為“淘選”。反復(fù)的篩選可逐步提高特異性識別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。
 

圖4 噬菌體展示技術(shù)一般技術(shù)流程
 

噬菌體展示技術(shù)會用到抗體庫，而抗體庫一旦建成，便可永久保存，不需要反復(fù)免疫和建庫，允許反復(fù)篩選，且篩選后不再需要對每個抗體基因進(jìn)行單獨克隆，直接進(jìn)行分子轉(zhuǎn)化，而雜交瘤的候選克隆無法長期穩(wěn)定，初篩和亞克隆的時間窗口很短，有時需要反復(fù)免疫、融合和篩選，費時費力。另外噬菌體展示技術(shù)可以針對的抗原極為廣泛，但由于噬菌體無法浸染過長的序列，因而需要額外加入“組合”步驟，而組合后的單抗偶爾會出現(xiàn)失去親和力或者產(chǎn)生自體免疫的現(xiàn)象。

三、轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)
1985年，Alt等人首次提出利用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生全人源的抗體的概念。轉(zhuǎn)基因抗體小鼠的構(gòu)建需要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出缺乏原有抗體基因的小鼠胚胎，再將人源抗體基因移植入小鼠體內(nèi)，迫使小鼠表達(dá)的抗體全部擁有人源序列，進(jìn)而再通過傳統(tǒng)雜交瘤創(chuàng)造出全人源抗體。

此種生產(chǎn)方法能夠通過選擇雜交瘤從而出產(chǎn)親和力極高的全人源單抗，比傳統(tǒng)的嵌合抗體更具免疫多樣性。但是由于增加的轉(zhuǎn)基因步驟需要從胚胎階段開始培育小鼠，且需要植入的基因序列極長，以被準(zhǔn)確表達(dá)，其生產(chǎn)過程比傳統(tǒng)雜交瘤復(fù)雜得多。

相比于鼠源抗體，人源抗體可以更好地避免耐藥性的發(fā)生。鼠源抗體仍可被免疫系統(tǒng)識別，并觸發(fā)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，這使得在反復(fù)用藥時身體會產(chǎn)生大量中和抗體從而減弱藥效。而人源抗體由于序列與人體自身的受體更接近，在進(jìn)入人體之后更難被免疫系統(tǒng)識別，當(dāng)重復(fù)用藥時藥效減弱程度較鼠源CAR-T更小。

而相較于噬菌體展示技術(shù)，轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)不需要經(jīng)過基因克隆、分子轉(zhuǎn)換和表達(dá)重組抗體的步驟，僅需經(jīng)過動物免疫、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合、小鼠腹水制備和單抗純化就可以完成人源抗體的初篩和功能鑒定。
 

表1 基于轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)開發(fā)的已上市的治療性抗體

總之，抗體發(fā)現(xiàn)是一個包括動物免疫、分子克隆、免疫學(xué)檢測、功能評價等多個環(huán)節(jié)的綜合技術(shù)體系。各種篩選技術(shù)中，噬菌體展示抗體庫和（人源化）雜交瘤互有特點和優(yōu)勢，應(yīng)用相對最廣。我們應(yīng)根據(jù)疾病的發(fā)病機(jī)制和靶點的特性綜合考慮，選擇合理抗體篩選技術(shù)，從而更高效地篩選出優(yōu)質(zhì)候選功能抗體。