酶抑制IC50試驗(yàn)研究原理和試驗(yàn)方法

1    酶抑制研究的重要性

藥物代謝的主要場(chǎng)所是肝臟，其中細(xì)胞色素 P450（CYP）酶為主要的代謝酶，其亞型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4參與了體內(nèi)80%以上的藥物代謝。CYP酶是一個(gè)多功能的酶系，在體內(nèi)具有可誘導(dǎo)性和可抑制性。該酶與藥物的相互作用能夠在所有的體內(nèi)過程（包括吸收、分布、代謝和排泄）中發(fā)生，其中以代謝過程最為突出，約占40%。

近年發(fā)現(xiàn)，藥物相互作用是臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡的主要原因之一。CYP參與的藥物相互作用主要包括兩種類型：酶抑制（enzyme inhibition）和酶誘導(dǎo)（enzyme induction）。酶抑制是指某些化合物能抑制肝臟藥物代謝酶的活性，導(dǎo)致聯(lián)合用藥時(shí)一些藥物代謝減慢，使得藥物的血藥濃度上升致毒性；酶誘導(dǎo)是指某些化合物能提高肝臟藥物代謝酶的活性，導(dǎo)致合同的藥物代謝速率加快，使得原藥的血藥濃度下降，使其療效降低或喪失。
 
為獲得更好的治療效果，聯(lián)合用藥在臨床治療中已非常普遍。然而，在獲得更好的療效的同時(shí)，常伴隨著由藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）引起的不良反應(yīng)事件的發(fā)生。如特非那丁與酮康唑合用時(shí)，酮康唑可顯著地抑制特非那丁的代謝，造成特非那丁的血藥濃度顯著升高，可以導(dǎo)致致命的室間心律失常。

圖2為采用肝微粒體技術(shù)研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實(shí)例，結(jié)果表明環(huán)孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對(duì)西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會(huì)影響臨床療效的正常發(fā)揮。
 
如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導(dǎo)代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變，這種藥物相互作用可能會(huì)影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發(fā)不良反應(yīng)。因此，通過對(duì)代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中必不可少的一部分。

2    酶抑制IC50研究試劑盒簡(jiǎn)介

參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個(gè)家族，共有7種重要的亞型，分別為CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。通過考察不同濃度的藥物對(duì)各種酶亞型的特異性底物的代謝速率的影響，得到半數(shù)抑制濃度（IC50），便可評(píng)價(jià)藥物對(duì)酶的抑制作用。

公司針對(duì)酶抑制IC50研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，開發(fā)了一款專門用于酶抑制IC50研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物對(duì)CYP450活性抑制的的研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，符合酶抑制IC50研究試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

2.1 產(chǎn)品說明

本產(chǎn)品提供了藥物酶抑制（IC50）研究的主要試劑，可直接用于藥物對(duì)CYP450酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）研究，省去了試劑配制的繁瑣過程，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

根據(jù)微粒體種屬的不同，可根據(jù)實(shí)際需求選擇人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體中的一種。
2.2 試劑盒優(yōu)勢(shì)

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定——本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。
2.4 參考使用方法

2.4.1 試驗(yàn)組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預(yù)孵育5min；

3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應(yīng)加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動(dòng)代謝反應(yīng)，使用秒表計(jì)時(shí)；

4）于設(shè)定孵育時(shí)間點(diǎn)，向孵育體系中加入終止液終止反應(yīng)（如預(yù)冷乙腈，預(yù)冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）。

例：200μL孵育體系配制：
 
注：
a.體系中有機(jī)溶劑加入量不得大于1%；

b.若實(shí)際需要n個(gè)孵育體系，則需配置n＋1個(gè)體系；

c.本實(shí)驗(yàn)需設(shè)置系列受試物濃度，通常為0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L；

d.參考使用方法僅為使用范例，需根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。

2.4.2對(duì)照組：

無A、B液組：反應(yīng)體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補(bǔ)齊。

2.4.3結(jié)果計(jì)算：

用各特異性探針底物的代謝物的生成速率反映微粒體孵育體系中各CYP450亞型酶的活性；設(shè)定只含代謝底物的孵育體系中各亞型酶活性為100%，作為對(duì)照；樣品中代謝物生成速率相對(duì)于對(duì)照組生成速率的百分比，作為各亞型酶的剩余活性。

活性剩余百分比 = (某濃度樣品底物代謝物生成速率/零濃度樣品代謝物生成速率) × 100%

2.4.4使用注意事項(xiàng)：

1）試驗(yàn)開始前，請(qǐng)自行準(zhǔn)備2.0mL離心管、不同規(guī)格槍頭、37℃水浴鍋等；

2）本產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動(dòng)物的治療或臨床診斷；

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻；

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復(fù)凍融；

5）在使用過程中，也可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整試劑盒使用方法和各組分的加入量；

6）因CYP2B6和CYP2C19在體外沒有絕對(duì)特異的抑制劑可用，故結(jié)果分析還需結(jié)合其它結(jié)果進(jìn)行，如重組酶法的結(jié)果。

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