小鼠基礎(chǔ)知識六：什么是Cre-lox

Cre- lox系統(tǒng)

是以小鼠作為研究工具，可對體內(nèi)進行組織時空特異性的基因敲除、敲入及示蹤。Cre-lox系統(tǒng)因其成熟高效的特性，已被廣泛應(yīng)用于各項體內(nèi)實驗研究中。
 
在接下來的基礎(chǔ)系列里，J博士將分別從以下幾個角度系統(tǒng)地介紹Cre-Lox，如果感興趣其中某一部分，敬請關(guān)注杰克森實驗室微信公眾號的相關(guān)文章： 
▲ 小鼠基礎(chǔ)知識系列六：什么是Cre-Lox？
▲ 小鼠基礎(chǔ)知識系列七：小鼠配繁和鑒定策略
▲ 小鼠基礎(chǔ)知識系列八：Tamoxifen誘導(dǎo)型cre
▲ 小鼠基礎(chǔ)知識系列九：四環(huán)素誘導(dǎo)型cre
 
 
那么，什么是Cre-Lox呢? 在這篇文章里，J博士將從基本原理、應(yīng)用場景和如何檢索相關(guān)小鼠品系三方面為大家介紹。
 
►►► 1、Cre-Lox基本原理：

Cre (Cre recombinase 重組酶)：最初在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，特異性識別loxP位點，可以對兩個loxP位點進行催化重組。

loxP位點（圖1）：34個堿基對構(gòu)成的回文序列，中間間隔的8個堿基對決定了loxP位點的方向。兩個loxP位點的位置和方向決定了Cre重組的方式，包括敲除，反轉(zhuǎn)和易位。
   
►►► 2、Cre-loxP應(yīng)用場景：
 
攜帶loxP的小鼠被稱為Floxed小鼠，當(dāng)它與Cre小鼠交配后，Cre-lox系統(tǒng)開始工作，可以對兩個loxP位點以內(nèi)的基因進行重組，進而實現(xiàn)基因敲除、表達等目的。

組織特異性敲除（Conditional Knockout, cKO）
如圖2所示意，當(dāng)組織特異性Cre小鼠與Floxed小鼠配繁后，兩個loxP位點位于同一條染色體上，且方向相同。Cre重組酶可以介導(dǎo)特定組織中兩個同向loxP位點發(fā)生同源重組。致使“Gene X”處序列被刪除，如果該序列的刪除使得該基因發(fā)生移碼突變，則達到基因敲除的效果。
   
例如：B6.FVB-Tg(Pdx1-cre)6Tuv/J (strain#:014647), 該品系是由mouse Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1) 啟動子驅(qū)動的Cre小鼠，與Floxed小鼠配繁，可以靶向胰腺組織進行特異性敲除。
 
具有組織靶向性的Cre小鼠品系很多，在文章后面會介紹如何檢索。
 
組織特異性過表達（Conditional Knockin, cKI）
Floxed小鼠轉(zhuǎn)入某個基因的編碼序列，并在這段編碼序列前面插入“LoxP-STOP-LoxP, LSL”元件（圖3）。因此，該Floxed小鼠并不表達插入的基因；當(dāng)存在Cre重組酶時，STOP元件被刪除，插入基因才會表達。該體系可用于構(gòu)建基因條件性敲入小鼠模型。
   
Cre報告品系及譜系示蹤
對于Floxed小鼠而言，如果LSL元件后續(xù)插入的基因編碼為LacZ、GFP等基因。當(dāng)存在細胞或組織特異性的Cre重組酶時, STOP元件被刪除, 后續(xù)基因可以顯色或表達熒光基因，從而可以實現(xiàn)對某類細胞或特定組織示蹤的目的。
 
Cre-ER系統(tǒng)
Cre-ER是Cre重組酶與雌激素受體(estrogen receptor, ER)激素結(jié)合域的融合蛋白。未使用雌激素或雌激素類似物他莫昔芬（Tamoxifen）誘導(dǎo)時，Cre重組酶停留在細胞質(zhì)中，無法對loxP位點進行重組。在經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，Cre重組酶進入細胞核中啟動loxP位點重組。(圖4)
   
因此，組織特異性Cre-ER和loxP的結(jié)合使用，可以實現(xiàn)對基因空間、時間的雙重調(diào)控。Cre-ER的改進版本——Cre-ERT2，在雌激素結(jié)合域攜帶G400V/M543A/L544A三位點突變，其在無誘導(dǎo)物情況下本底活性更低，而對Tamoxifen的敏感性卻更高。關(guān)于誘導(dǎo)型Cre的相關(guān)問題，我們會在小鼠基礎(chǔ)知識系列第八講中為大家進行更加詳細的介紹。
 
►►► 3、Cre-lox數(shù)據(jù)資源庫

JAX收錄了1000多種Cre表達的小鼠以及更多的Floxed小鼠。其中很多小鼠都有較多的文獻引用和驗證數(shù)據(jù)。可以使用JAX小鼠搜索引擎快速查找相關(guān)品系。
 
Floxed品系查找
使用JAX® Mice Database(JAX®小鼠資源庫)：www.jax.org/mouse-search來進行搜索。您可以使用篩選框內(nèi)Strain Attributes – Conditional ready (e.g. floxed)條件（如圖5）。
   
Cre品系查找
您同樣可以使用JAX® Mice Database(JAX®小鼠資源庫)：www.jax.org/mouse-search，通過關(guān)鍵詞來搜索cre表達的品系。搜索時，在左側(cè)篩選框中選擇➡️“Cre Expressing”即可。
 
除此以外，在JAX®的常用Cre小鼠目錄中提供了多種在不同組織中已經(jīng)驗證過特異表達的Cre小鼠，您可以在該網(wǎng)頁中尋找您想要的特定組織Cre表達小鼠➡️➡️➡️https://www.jax.org/research-and-faculty/resources/cre-repository/characterized-cre-lines-jax-cre-resource
 
如果以上沒有您需要的Cre小鼠，還可以通過MGI的Cre Portal (www.creportal.org)網(wǎng)頁進行搜索，如圖6。
   
以上，就是J博士為大家講解的本期小鼠基礎(chǔ)知識的全部內(nèi)容，后續(xù)我們還將會推出更多、更新、更有意思的小鼠基礎(chǔ)知識內(nèi)容，敬請期待！