腸道菌群代謝組學(xué)的應(yīng)用：苯乙酸PAA能夠誘發(fā)脂肪性肝病

脂肪性肝�。ㄖ�肪肝，hepatic steatosis），正嚴(yán)重威脅國人的健康，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，發(fā)病率在不斷升高，且發(fā)病年齡日趨年輕化。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，脂肪肝一般分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝兩大類。根據(jù)脂肪變性在肝臟累及的范圍，又可分為輕、中、重三型，通常脂肪含量超過肝臟重量的5%～10%時(shí)被視為輕度脂肪肝，超過10%～25%為中度脂肪肝，超過25%為重度脂肪肝。這種肝臟疾病通常與肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、酒精和糖尿病相關(guān)[1-5]。一般而言，脂肪肝屬可逆性疾病，早期診斷并及時(shí)治療�？苫謴�(fù)正常，比如在臨床上主要應(yīng)用胰島素增敏劑、調(diào)脂藥以及抗氧化劑等治療非酒精性脂肪肝（NAFLD）。

據(jù)估計(jì)，三分之一的成年人可能具有早期階段的NAFLD，但在疾病進(jìn)展之前沒有或者很少有癥狀呈現(xiàn)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，血液檢查和超聲波掃描這些診斷技術(shù)只有在已經(jīng)存在明顯的肝損傷時(shí)才查得到，那時(shí)已經(jīng)延誤了治療時(shí)機(jī)。

 

不過，根據(jù)發(fā)表在《Nature Medicine》上的一項(xiàng)研究，腸道微生物及其芳香族氨基酸代謝物-苯乙酸（phenylacetic acid，PAA）似乎也促進(jìn)了疾病發(fā)展[6]，表明有望通過糞便微生物移植來治療，微生物產(chǎn)生的化學(xué)副產(chǎn)物有可能被用作疾病的早期預(yù)警信號(hào)，它們可以用簡單的血檢來檢測。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，為了深入研究微生物-宿主的相互作用是否促進(jìn)了疾病發(fā)展，英國、西班牙、意大利等地的研究人員招募了105名研究的對(duì)象，分別是44名西班牙的婦女和61名意大利的婦女，她們正在醫(yī)院準(zhǔn)備進(jìn)行胃旁路手術(shù)，以治療肥胖。這些婦女在手術(shù)前捐贈(zèng)了樣本，包括糞便、尿液、血漿和肝臟活檢樣本。所有參與者都被列為病態(tài)肥胖，并且沒有病毒性肝炎、癌癥和2型糖尿病。
 

圖 1 項(xiàng)目研究思路

如圖1所示，本研究先對(duì)募集的105名研究對(duì)象的臨床收集的數(shù)據(jù)信息通過數(shù)據(jù)擬合分析發(fā)現(xiàn)可能的臨床混雜因素，比如年齡、BMI、國家；然后在進(jìn)行組學(xué)分析的時(shí)候盡量使用偏向關(guān)系分析pSRC等算法對(duì)這些混雜因素校正，接著主要對(duì)56個(gè)病人進(jìn)行脂肪肝分型（0、1、2、3期），并進(jìn)行糞便宏基因組學(xué)、肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)、血漿和尿液（n=102）代謝組學(xué)檢測、肝臟脂肪測定、肝臟組織學(xué)圖譜及其他脂肪肝相關(guān)的臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)采集，后續(xù)進(jìn)行跨組學(xué)關(guān)聯(lián)分析、疾病診斷分型分析、糞便菌群移植實(shí)驗(yàn)、代謝物-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、代謝物-小鼠填喂實(shí)驗(yàn)等表明菌群和代謝物與脂肪肝密切相關(guān)。
 

圖2 宏基因組學(xué)MGR與脂肪肝的關(guān)聯(lián)

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，通過對(duì)糞便樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)檢測，以微生物基因豐富度（microbial gene richness，MGR）對(duì)樣本進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)樣本平均基因數(shù)是558,246 ± 154,249，進(jìn)而可以劃分為low MGR組和high MGR組。研究發(fā)現(xiàn)（圖2a），隨著脂肪肝的疾病發(fā)展，對(duì)于肝脂肪變性不太嚴(yán)重的個(gè)體，腸道微生物組中的微生物基因豐富度相對(duì)較高，而對(duì)于那些嚴(yán)重的肝脂肪變性病例，微生物基因豐富度較低；此外，MGR同肝功能相關(guān)指標(biāo)（如γ-glutamyltransferase、alanine amino-transferase and inflammation (C-reactive protein)）具有顯著性負(fù)相關(guān)作用（圖2b），與LDL cholesterol、Triglycerides 具有顯著性正相關(guān)作用；在微生物門水平上發(fā)現(xiàn)Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門） 和 Verrucomicrobia （疣微菌門）與脂肪肝臨床診斷指標(biāo)具有顯著性正相關(guān)作用，而 Firmicutes（厚壁菌門）和Euryarchaeota （廣古菌門）與脂肪肝臨床診斷指標(biāo)具有負(fù)相關(guān)作用。研究中還發(fā)現(xiàn)肝臟疾病似乎與腸道微生物組中某些基因功能的存在相一致，包括脂肪酸合成、糖代謝、支鏈氨基酸或芳香族氨基酸的代謝通路（圖3）。 
 

圖3 腸道菌群功能模塊與臨床指標(biāo)的偏相關(guān)結(jié)果

為了闡述清楚微生物可能作用于脂肪肝形成的靶向物質(zhì)，該研究采用了核磁非靶向代謝組學(xué)和質(zhì)譜的靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)血漿和尿液樣本進(jìn)行檢測，不同于常規(guī)代謝組使用VIP值、Q值、fold-change值的差異物統(tǒng)計(jì)分析，而采用偏相關(guān)系數(shù)進(jìn)行代謝物與脂肪肝臨床指標(biāo)的分析（圖4），對(duì)血漿和尿液都分別通過2次對(duì)比：1）疾病分型；2）菌群MGR分型，找到2種分組下與臨床指標(biāo)關(guān)聯(lián)代謝物（校正后P值<0.05的代謝物就是與臨床指標(biāo)密切關(guān)聯(lián)的代謝物，如圖4中紅色和藍(lán)色的點(diǎn)）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，血漿和尿液中分別發(fā)現(xiàn)80和124個(gè)代謝物與脂肪肝臨床指標(biāo)具有顯著性關(guān)聯(lián)。如圖5所示，血漿和尿液樣本中的支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）在脂肪肝患者中都出現(xiàn)顯著性變化，此外還發(fā)現(xiàn)菌群參與苯丙氨酸代謝的副產(chǎn)物-苯乙酸PAA 與脂肪肝臨床表型具有最強(qiáng)的顯著性關(guān)聯(lián)(p-FDR=4.69×10−5)，所以后續(xù)可對(duì)PAA代謝物進(jìn)行細(xì)胞和小鼠造模的功能性研究。 
 

圖4 代謝組學(xué)研究與脂肪肝臨床指標(biāo)的偏相關(guān)結(jié)果
 

圖5 與脂肪肝和微生物相關(guān)的代謝物
 

上述結(jié)果表明脂肪肝患者的腸道菌群和代謝物出現(xiàn)了顯著性變化，為了揭示腸道菌群是否會(huì)影響肝臟代謝變化，對(duì)肝臟組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測。如圖6所示，按照MGR豐富度高低進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)了2277個(gè)基因與脂肪肝和low MGR有關(guān)聯(lián)，pathway的富集分析表明主要是病毒細(xì)菌類的免疫應(yīng)答、胰島素耐受（如胰島素受體表達(dá)基因INSR表達(dá)降低）等方面具有顯著性差異。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，此外，脂蛋白脂肪酶基因LPL表達(dá)增高，長短鏈乙酰輔酶A脫氫酶基因ACADSB表達(dá)降低可能與脂類物質(zhì)堆積與密切關(guān)系。上述結(jié)果將腸道菌群參與的支鏈氨基酸和芳香族氨基酸代謝、血漿和尿液中的支鏈氨基酸和芳香族氨基酸副產(chǎn)物、肝臟的胰島素受體和脂類合成基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與胰島素耐受、脂肪肝、low MGR的關(guān)系聯(lián)系在一起。
 

圖6 肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
 

多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群參與的支鏈氨基酸代謝、芳香族氨基酸代謝與脂肪肝的形成具有一定的關(guān)聯(lián)，為了更加確定因果關(guān)系，從人類捐贈(zèng)者轉(zhuǎn)移腸道細(xì)菌導(dǎo)致小鼠發(fā)育脂肪肝，表明腸道菌群構(gòu)成的變化在該疾病中發(fā)揮作用。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，其中移植的人體腸道菌群數(shù)據(jù)通過使用SIMCA軟件的OPLS回歸模型，能夠較好地預(yù)測小鼠的表型變化，主要體現(xiàn)在肝臟甘油三酯水平、Fabp4基因表達(dá)和血漿的纈氨酸水平（如圖7所示）。
 

圖7 OPLS模型進(jìn)行表型預(yù)測
 

除了對(duì)腸道菌群進(jìn)行糞菌移植實(shí)驗(yàn)證明腸道菌群在脂肪肝發(fā)病中的重要作用，該研究還對(duì)微生物代謝物苯乙酸PAA進(jìn)行細(xì)胞和小鼠的功能試驗(yàn)驗(yàn)證。棕櫚酸（palmitic acid，PA）被報(bào)導(dǎo)能夠誘導(dǎo)人體原代肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪累積，因此以PA作為陽性對(duì)照，使用PAA進(jìn)行原代肝細(xì)胞飼養(yǎng)，從圖8a中可以清楚發(fā)現(xiàn)PAA和PA一樣能夠促進(jìn)細(xì)胞的脂肪堆積，還發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)與上述的研究具有一定的趨同性，比如LPL（脂蛋白降解酶）和FASN（脂肪酸合成基因）表達(dá)量高，表明原代肝細(xì)胞的脂類合成能力增強(qiáng)；INSR（胰島素受體基因）表達(dá)增高，GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2）表達(dá)降低，且胰島素信號(hào)中的磷酸化蛋白表達(dá)量低，細(xì)胞仍處于胰島素耐受狀態(tài)。PAA物質(zhì)的小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)表明PAA能夠增加小鼠肝臟的甘油三酯，降低小鼠尿液異亮氨酸的排泄量（圖8l-m）。
 

圖8 微生物代謝物-苯乙酸PAA的細(xì)胞和小鼠造模實(shí)驗(yàn)

為了檢測組學(xué)技術(shù)能否進(jìn)行脂肪肝疾病的早期預(yù)警和預(yù)測，使用SIMCA軟件中的OPLS-DA數(shù)據(jù)模型對(duì)脂肪肝患者進(jìn)行臨床診斷分析，其中將脂肪肝0期的樣本作為一組，將脂肪肝1期、脂肪肝2期、脂肪肝3期的樣本作為一組，樣本數(shù)是10 VS 46。如圖9所示，使用無創(chuàng)臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行疾病診斷分析，AUC=58.38%；加上微創(chuàng)的血糖檢測指標(biāo)（如oral glucose tolerance tests 和 EHCs），AUC=68.69%；這些疾病判斷結(jié)果明顯低于組學(xué)技術(shù)最弱的診斷結(jié)果（尿液代謝組AUC=69.39%）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，以肝臟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)診斷結(jié)果為參考，在單一組學(xué)上可以發(fā)現(xiàn)血漿代謝組（AUC=79.60%）和糞便宏基因組（AUC=72.73%）比尿液代謝組具有更好的預(yù)測能力，三個(gè)組學(xué)合并具有最高的疾病診斷能力（AUC=87.07%）。
 

圖9 OPLS-DA模型的疾病診斷分析

綜上所述：
1. 研究分析女性脂肪肝患者的糞便宏基因組、分子表型組（肝轉(zhuǎn)錄組、血漿和尿液代謝組）和臨床表型；

2. 發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者腸道菌群基因豐富度低，菌群的膳食脂質(zhì)代謝、內(nèi)毒素、芳香族和支鏈氨基酸的生物合成能力增強(qiáng)；

3. 與菌群結(jié)果一致的是患者的代謝組特征，而且肝臟免疫炎癥等基因表達(dá)增強(qiáng)；

4. 糞菌移植實(shí)驗(yàn)表明腸道菌群可引發(fā)脂肪肝，長期苯乙酸（PAA，菌群芳香族氨基酸代謝產(chǎn)物）攝入也有相似作用；

5. 基于分子表型組學(xué)和宏基因組學(xué)的建�？捎糜陬A(yù)測脂肪肝情況。

然而，研究人員強(qiáng)調(diào)，尚不清楚PAA是否與疾病直接相關(guān)，或者它們的增加是否與細(xì)菌平衡的臨界點(diǎn)相關(guān)，還需要進(jìn)行更多工作來探索這些聯(lián)系，看看像PAA這樣的化合物是否確實(shí)可以用來鑒別處于危險(xiǎn)中的患者，甚至預(yù)測疾病的進(jìn)展，這將為GP診所（一種在英國普遍存在的小診所）進(jìn)行簡單的篩查試驗(yàn)提供了一種可能性。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，好消息是，通過操縱腸道細(xì)菌，我們可能能夠預(yù)防脂肪肝疾病及其并發(fā)癥。

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