罕見病杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)的介紹與基因檢測(cè)療法的應(yīng)用

疾病概述
對(duì)于父母來(lái)說(shuō)見證寶寶一點(diǎn)點(diǎn)學(xué)會(huì)走路，從獨(dú)立行走再到學(xué)會(huì)奔跑，是多么難忘的時(shí)刻！但對(duì)于患了杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良罕見病的寶寶來(lái)說(shuō)，他們不能用自己的雙腿走路、奔跑；對(duì)于普通人再平常不過(guò)的行動(dòng)，對(duì)他們卻成了一種可望而不可及的夢(mèng)想。

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy, DMD）是一種X連鎖隱性遺傳的肌肉變性疾病，活產(chǎn)男嬰發(fā)病率為1/3500，女性多為致病基因攜帶者，發(fā)病者罕見，且癥狀較輕。在男患中癥狀較重，DMD發(fā)病年齡偏小，起病隱蔽，病程長(zhǎng)，2-5歲患者全身骨骼肌進(jìn)行性無(wú)力、萎縮和小腿腓腸肌假性肥大，走路呈現(xiàn)鴨步態(tài)、易摔跤、上下樓梯難，10歲左右因肌無(wú)力癥狀漸進(jìn)性發(fā)展而不能行走，20歲左右會(huì)患心力衰竭或墜積性肺炎等消耗性疾病。目前該病發(fā)病機(jī)制尚未闡明且暫無(wú)有效治療方法�，F(xiàn)有治療只能減緩DMD患者肌肉萎縮進(jìn)程，延長(zhǎng)3-5年行走能力，增強(qiáng)心肺功能^[1-2]。
 

圖1 DMD患者小腿腓腸肌假性肥大

Dys基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)以及功能
Dys基因結(jié)構(gòu)：DMD由抗肌萎縮蛋白（Dystrophin, Dys）基因突變所致，屬于進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥常見類型。已證實(shí)人類Dys基因定位于X染色體短臂上（Xp21.1-3），基因全長(zhǎng)約2220kb，含79個(gè)外顯子，cDNA長(zhǎng)14kb，是目前已知的最大人類基因。

全長(zhǎng)型抗肌萎縮蛋白存在于骨骼肌的肌膜下，由3685個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為427KDa。共分為4個(gè)區(qū)域，如圖2B中的全長(zhǎng)所示：（1）氨基端區(qū)域：與a-輔肌動(dòng)蛋白（a-actinin）同源，包含第14-240氨基酸，跨越1-8號(hào)外顯子，與細(xì)胞內(nèi)的絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）相連接；（2）中央棒狀區(qū)：包含第253-3040氨基酸，跨越9-63號(hào)外顯子，由24個(gè)三聚螺旋狀重復(fù)結(jié)構(gòu)（repeat, R）組成，每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)由109個(gè)氨基酸組成，與a-肌動(dòng)蛋白（a-actin）和血影蛋白（spectrin）同源。重復(fù)結(jié)構(gòu)被4個(gè)富含脯氨酸的鉸鏈（hinge, H）結(jié)構(gòu)分隔開，在4個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)處轉(zhuǎn)折形成三股螺旋狀結(jié)構(gòu)；（3）富含半胱氨酸區(qū)域：第3080-3360氨基酸，跨越64-68號(hào)外顯子，與位于肌膜上的糖蛋白復(fù)合體相連，此區(qū)是與肌膜結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)；（4）羧基端區(qū)域：第3361-3685氨基酸，跨越68-79號(hào)外顯子，含有許多磷酸化位點(diǎn)，與細(xì)胞內(nèi)的syntrophins蛋白相連。

Dys基因表達(dá)具有組織特異性。該基因由7個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子控制在不同組織中表達(dá)（圖2A）。其中有3個(gè)啟動(dòng)子分別控制在大腦、肌肉和小腦浦肯野纖維中的表達(dá)，表達(dá)亞型為基因全長(zhǎng)。3個(gè)全長(zhǎng)亞型包括唯一的一個(gè)從1-79號(hào)外顯子的連接；另外4個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子，啟動(dòng)較短形式的抗肌萎縮蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，以DMD基因第30、45、56、和63號(hào)外顯子作為第一個(gè)外顯子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物分別為Dp260（Mr=260000）、Dpl40（Mr=140000）、Dpl16（Mr=116000）和Dp71（Mr=71000）。

圖2 抗肌萎縮蛋白基因及表達(dá)^[3]

A.位于Xp21，黑色的豎線代表分布于整個(gè)基因上的79個(gè)外顯子，黑色箭頭指示各組織特異性啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)位點(diǎn)，分別以不同的字母縮寫來(lái)代表：B（腦皮質(zhì)）、M（肌組織）、P（蒲肯野纖維）、R（視網(wǎng)膜）、B3（腦組織）、S（雪旺細(xì)胞）和G（肌組織之外的多種組織器官）。

B.不同形式的抗肌萎縮蛋白及其區(qū)域組成：氨基端區(qū)域、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域。

Dys的功能：Dys的羧基端和富含半胱氨酸的區(qū)域在整個(gè)框架蛋白中發(fā)揮作用，如圖3所示：Dys和抗肌萎縮蛋白聚糖（dystroglycans）、sarcoglycan、syncoilin、syntrophin和dystrobrevin等蛋白裝配在一起形成抗肌萎縮蛋白的結(jié)合蛋白復(fù)合物（dystrophin-associated protein complex, DAPC）。DAPC形成了一個(gè)穿過(guò)肌膜傳遞信號(hào)，連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架的重要結(jié)構(gòu)。Dys基因表達(dá)的缺乏會(huì)影響DAPC的形成，使分子橋中斷，至少導(dǎo)致兩個(gè)結(jié)果：第一，細(xì)胞膜變得更脆弱，在肌肉離心性收縮的時(shí)候會(huì)被機(jī)械力破壞；第二，框架蛋白，尤其是對(duì)機(jī)械力敏感的離子通道將會(huì)失調(diào)^[3]。

圖3 抗肌萎縮蛋白及相關(guān)蛋白在肌細(xì)胞膜上的功能^[3]

抗肌萎縮蛋白的多樣性蛋白在細(xì)胞膜上形成了一種穩(wěn)定連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)骨架的連接結(jié)構(gòu)
 

圖4 杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者呈進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良
 

臨床檢測(cè)
DMD相關(guān)臨床檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室檢查
DMD血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）等均增高，尤其是CK顯著增高，可達(dá)正常者的50倍。DMD血清學(xué)檢測(cè)值增高多發(fā)生在早期和進(jìn)展期，在晚期不明顯，CK值增高是本病的特征性臨床表現(xiàn)，在患兒出現(xiàn)明顯的臨床癥狀前，已有顯著增加，特異性很高^[3]。

肌電圖
通常提示肌源性損害｡

肌肉活檢
早期表現(xiàn)非特征性，晚期出現(xiàn)肌細(xì)胞萎縮,脂肪、結(jié)締組織增生，免疫組化或免疫印跡提示抗肌萎縮蛋白明顯減少或消失。

超聲心動(dòng)圖
擴(kuò)張型心肌病改變｡

呼吸功能
提示呼吸肌無(wú)力,呼吸功能降低^[5]。

診斷進(jìn)展
DMD新生兒篩查已在英國(guó)、德國(guó)、美國(guó)等國(guó)家進(jìn)，其方法為以CK作為檢測(cè)指標(biāo),陽(yáng)性召回病例經(jīng)DMD基因檢測(cè)確診，使DMD診斷進(jìn)一步提前。浙江省篩查中心2016-2017年共篩查42862例浙江省出生男性新生兒,基因確診11例，發(fā)病率1：3896。DMD篩查不僅使患者得到早期診斷、早期治療，同時(shí)為有先證者家庭的下一胎產(chǎn)前診斷提供幫助，真正做到減少DMD缺陷患兒的出生。這可以通過(guò)絨毛膜取樣或羊膜腔穿刺技術(shù)完成。DMD篩查目前仍存在較高的假陽(yáng)性率及假陰性率，有待進(jìn)一步研究改進(jìn)^[5]。

以往DMD診斷通常在患兒出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能減退，腓腸肌肥大后，通過(guò)肌酸激酶、肌電圖及肌活檢證實(shí)。近年隨著基因檢測(cè)技術(shù)的快速進(jìn)展及數(shù)據(jù)庫(kù)的積累，基因檢測(cè)已成為目前診斷DMD的主要手段｡DMD基因定位于Xp21，是至今為止已知的人類最大基因 （2500kb），包括79個(gè)外顯子、78個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)啟動(dòng)子。突變形式多樣，其中大片段缺失約占DMD65%；大片段重復(fù)約占DMD5%-10%；其余突變?yōu)槲⑿⊥蛔儯�包括堿基的缺失、插入、置換、內(nèi)含子突變、復(fù)雜的染色體重排等。DMD患兒的臨床表現(xiàn)與患兒DMD的基因缺失之間的關(guān)系取決于基因突變是否對(duì)翻譯閱讀框架造成改變，即“閱讀框架規(guī)則”。大多數(shù)破壞閱讀框架的突變會(huì)導(dǎo)致Dstrophin蛋白質(zhì)的丟失，使患者產(chǎn)生DMD表現(xiàn)。當(dāng)DMD基因突變存在于閱讀框內(nèi)時(shí)，可產(chǎn)生一種截短的、仍有部分功能的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，使患者表現(xiàn)為臨床癥狀較為溫和的貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（becker muscular dystrophy, BMD）^[6]。也有少部分患者不符合閱讀框的假設(shè)，而這些異常的原因尚不清楚。

近年隨著DMD基因檢測(cè)的快速進(jìn)展，出現(xiàn)一些通過(guò)基因型預(yù)測(cè)表型的軟件工具。有學(xué)者運(yùn)用其開發(fā)的計(jì)算機(jī)軟件“DMD toolkit”，利用相關(guān)系數(shù)，回歸系數(shù)，譜系圖，直方圖，趨勢(shì)線的散點(diǎn)圖，莖葉圖等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)可視化突變位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)抗肌萎縮蛋白突變位點(diǎn)功能改變，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法預(yù)測(cè)DMD臨床表型^[5]。廣州罕見病基因治療聯(lián)盟的牽頭單位清華珠三角研究院聯(lián)合賽業(yè)生物開發(fā)了罕見病數(shù)據(jù)中心（RDDC）網(wǎng)站：https://rddc.tsinghua-gd.org/，RDDC對(duì)不同來(lái)源的同一基因信息進(jìn)行了深度整合，以高度簡(jiǎn)潔性和交互性提高研發(fā)者信息獲取效率，提供AI突變剪接預(yù)測(cè)、AI突變致病性預(yù)測(cè)等不同的工具為科研學(xué)者來(lái)帶便利，這些進(jìn)展大大減少了有創(chuàng)性肌肉活檢，也使肌損傷前診斷成為可能｡