小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞定株簡(jiǎn)要流程
實(shí)驗(yàn)材料：
DMEM高糖培養(yǎng)基 FBS/NBS
HT選擇培養(yǎng)基 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱
細(xì)胞計(jì)數(shù)器 單通道移液槍、多通道移液槍
相差顯微鏡 生物安全柜
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無(wú)菌離心管 [NEST]
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標(biāo)板 [NEST]
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
陽(yáng)性對(duì)照：
融合前采對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)的小鼠眼球血，37℃放置2h，然后4℃放置2h，最后10000rpm離心10min，取上清，-20℃條件下保存。（使用前提前解凍，稀釋1000倍備用）
陰性對(duì)照：
各個(gè)階段培養(yǎng)基留5ml左右，作為陰性對(duì)照用。
Elisa檢測(cè)板準(zhǔn)備：
將對(duì)應(yīng)抗原用CB以1μg/ml濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)（100μl/孔），4℃過(guò)夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍，清洗結(jié)束，加入封閉液封閉，37℃封閉1h，用1×PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存，-20℃長(zhǎng)期保存。
實(shí)驗(yàn)流程
融合檢測(cè)：
細(xì)胞融合換液后，等4~7天，觀察細(xì)胞融合狀態(tài)，大部分細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán)，即可開(kāi)始檢測(cè)。
用排槍取融合培養(yǎng)上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測(cè)板中，因?yàn)镋lisa檢測(cè)板來(lái)源于外部，切記從細(xì)胞培養(yǎng)板中單次取液，不可反復(fù)吸取，取一次液換一次槍頭，防止污染細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，以及交叉污染影響檢測(cè)結(jié)果。（每塊板預(yù)留一孔陽(yáng)性對(duì)照孔，一孔陰性培養(yǎng)基對(duì)照孔）
根據(jù)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的OD值，確定陽(yáng)性孔，取陽(yáng)性對(duì)照OD值得一半以上的數(shù)值為陽(yáng)性。
第一次亞克�。�
根據(jù)融合檢測(cè)的數(shù)據(jù)，挑選陽(yáng)性孔，將陽(yáng)性孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2~3天后采用Elisa方法復(fù)檢，防止假陽(yáng)性。
挑選24孔板中復(fù)檢陽(yáng)性的孔，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)懸，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中分散均勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后，根據(jù)計(jì)數(shù)情況比例稀釋細(xì)胞懸液，按照1個(gè)/孔的密度均勻鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，一個(gè)陽(yáng)性克隆株鋪一塊細(xì)胞培養(yǎng)板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養(yǎng)基的血清使用濃度略低于融合時(shí)的濃度，略高于SP2/0常規(guī)培養(yǎng)濃度，可按照5% 進(jìn)行區(qū)分]
畫(huà)克�。�
一次亞克隆后，融合細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5天后，采用相差顯微鏡逐孔觀察，在單孔內(nèi)有且只有一個(gè)正圓形細(xì)胞團(tuán)的孔，即為單克隆細(xì)胞孔，做好標(biāo)記。若無(wú)無(wú)單克隆孔，則挑選細(xì)胞團(tuán)較少的多克隆細(xì)胞孔，做好標(biāo)記。
一次亞克隆檢測(cè)：
畫(huà)克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用Elisa法進(jìn)行一次亞克隆檢測(cè)，優(yōu)選挑選陽(yáng)性單克隆孔，若無(wú)陽(yáng)性單克隆孔，則挑選克隆數(shù)較少的陽(yáng)性多克隆孔。挑選出來(lái)的細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至24孔擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)行陽(yáng)性克隆株復(fù)篩，確保挑選的細(xì)胞株非假陽(yáng)性。
二次亞克�。�
將一次亞克隆挑選出來(lái)的細(xì)胞株，重復(fù)一次亞克隆步驟。細(xì)胞培養(yǎng)基換成FBS-DMEM，培養(yǎng)基的血清使用濃度調(diào)整成SP2/0的常規(guī)培養(yǎng)濃度。
畫(huà)克隆
二次亞克隆后4~5天，進(jìn)行畫(huà)克隆，單克隆孔做好標(biāo)記。
二次亞克隆檢測(cè)：
畫(huà)克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，重復(fù)一次亞克隆檢測(cè)步驟，挑選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，準(zhǔn)備進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
建株：
陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株需進(jìn)行至少2次的亞克隆，檢測(cè)為全陽(yáng)方可建株！若為了保證穩(wěn)定性，建議進(jìn)行第三次亞克隆。
挑出兩次檢測(cè)均為單克隆且全為陽(yáng)性后，在24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增，2~3天后用Elisa法進(jìn)行交叉檢測(cè)（主要針對(duì)帶標(biāo)簽的蛋白抗原）和穩(wěn)定性鑒定。
檢測(cè)合格后挑選一個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，長(zhǎng)勢(shì)較好且陽(yáng)性O(shè)D值較高的細(xì)胞株，轉(zhuǎn)移至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，2~3天后，用亞型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定。
完成以上鑒定后，將單克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至100m細(xì)胞培養(yǎng)皿或者T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行大量擴(kuò)增。
擴(kuò)增完成后將單克隆細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞凍存，標(biāo)記好細(xì)胞名稱、凍存者、凍存日期等信息，放置凍存盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，一天后轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲(chǔ)存。
凍存后一周再?gòu)?fù)蘇檢測(cè)，防止細(xì)胞株出現(xiàn)產(chǎn)抗不穩(wěn)定現(xiàn)象，若檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題，則將細(xì)胞株錄入細(xì)胞庫(kù)中，并撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。（細(xì)胞凍存3支/株，且3支確保有2個(gè)及以上凍存批次，避免出現(xiàn)凍存失誤，細(xì)胞株丟失）
使用到的NEST產(chǎn)品：
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無(wú)菌離心管 [NEST]
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標(biāo)板 [NEST]
DMEM高糖培養(yǎng)基 FBS/NBS
HT選擇培養(yǎng)基 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱
細(xì)胞計(jì)數(shù)器 單通道移液槍、多通道移液槍
相差顯微鏡 生物安全柜
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無(wú)菌離心管 [NEST]
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標(biāo)板 [NEST]
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
陽(yáng)性對(duì)照：
融合前采對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)的小鼠眼球血，37℃放置2h，然后4℃放置2h，最后10000rpm離心10min，取上清，-20℃條件下保存。（使用前提前解凍，稀釋1000倍備用）
陰性對(duì)照：
各個(gè)階段培養(yǎng)基留5ml左右，作為陰性對(duì)照用。
Elisa檢測(cè)板準(zhǔn)備：
將對(duì)應(yīng)抗原用CB以1μg/ml濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)（100μl/孔），4℃過(guò)夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍，清洗結(jié)束，加入封閉液封閉，37℃封閉1h，用1×PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存，-20℃長(zhǎng)期保存。
實(shí)驗(yàn)流程
融合檢測(cè)：
細(xì)胞融合換液后，等4~7天，觀察細(xì)胞融合狀態(tài)，大部分細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán)，即可開(kāi)始檢測(cè)。
用排槍取融合培養(yǎng)上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測(cè)板中，因?yàn)镋lisa檢測(cè)板來(lái)源于外部，切記從細(xì)胞培養(yǎng)板中單次取液，不可反復(fù)吸取，取一次液換一次槍頭，防止污染細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，以及交叉污染影響檢測(cè)結(jié)果。（每塊板預(yù)留一孔陽(yáng)性對(duì)照孔，一孔陰性培養(yǎng)基對(duì)照孔）
根據(jù)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的OD值，確定陽(yáng)性孔，取陽(yáng)性對(duì)照OD值得一半以上的數(shù)值為陽(yáng)性。
第一次亞克�。�
根據(jù)融合檢測(cè)的數(shù)據(jù)，挑選陽(yáng)性孔，將陽(yáng)性孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2~3天后采用Elisa方法復(fù)檢，防止假陽(yáng)性。
挑選24孔板中復(fù)檢陽(yáng)性的孔，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)懸，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中分散均勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后，根據(jù)計(jì)數(shù)情況比例稀釋細(xì)胞懸液，按照1個(gè)/孔的密度均勻鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，一個(gè)陽(yáng)性克隆株鋪一塊細(xì)胞培養(yǎng)板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養(yǎng)基的血清使用濃度略低于融合時(shí)的濃度，略高于SP2/0常規(guī)培養(yǎng)濃度，可按照5% 進(jìn)行區(qū)分]
畫(huà)克�。�
一次亞克隆后，融合細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5天后，采用相差顯微鏡逐孔觀察，在單孔內(nèi)有且只有一個(gè)正圓形細(xì)胞團(tuán)的孔，即為單克隆細(xì)胞孔，做好標(biāo)記。若無(wú)無(wú)單克隆孔，則挑選細(xì)胞團(tuán)較少的多克隆細(xì)胞孔，做好標(biāo)記。
一次亞克隆檢測(cè)：
畫(huà)克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用Elisa法進(jìn)行一次亞克隆檢測(cè)，優(yōu)選挑選陽(yáng)性單克隆孔，若無(wú)陽(yáng)性單克隆孔，則挑選克隆數(shù)較少的陽(yáng)性多克隆孔。挑選出來(lái)的細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至24孔擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)行陽(yáng)性克隆株復(fù)篩，確保挑選的細(xì)胞株非假陽(yáng)性。
二次亞克�。�
將一次亞克隆挑選出來(lái)的細(xì)胞株，重復(fù)一次亞克隆步驟。細(xì)胞培養(yǎng)基換成FBS-DMEM，培養(yǎng)基的血清使用濃度調(diào)整成SP2/0的常規(guī)培養(yǎng)濃度。
畫(huà)克隆
二次亞克隆后4~5天，進(jìn)行畫(huà)克隆，單克隆孔做好標(biāo)記。
二次亞克隆檢測(cè)：
畫(huà)克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，重復(fù)一次亞克隆檢測(cè)步驟，挑選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，準(zhǔn)備進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
建株：
陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株需進(jìn)行至少2次的亞克隆，檢測(cè)為全陽(yáng)方可建株！若為了保證穩(wěn)定性，建議進(jìn)行第三次亞克隆。
挑出兩次檢測(cè)均為單克隆且全為陽(yáng)性后，在24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增，2~3天后用Elisa法進(jìn)行交叉檢測(cè)（主要針對(duì)帶標(biāo)簽的蛋白抗原）和穩(wěn)定性鑒定。
檢測(cè)合格后挑選一個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，長(zhǎng)勢(shì)較好且陽(yáng)性O(shè)D值較高的細(xì)胞株，轉(zhuǎn)移至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，2~3天后，用亞型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定。
完成以上鑒定后，將單克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至100m細(xì)胞培養(yǎng)皿或者T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行大量擴(kuò)增。
擴(kuò)增完成后將單克隆細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞凍存，標(biāo)記好細(xì)胞名稱、凍存者、凍存日期等信息，放置凍存盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，一天后轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲(chǔ)存。
凍存后一周再?gòu)?fù)蘇檢測(cè)，防止細(xì)胞株出現(xiàn)產(chǎn)抗不穩(wěn)定現(xiàn)象，若檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題，則將細(xì)胞株錄入細(xì)胞庫(kù)中，并撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。（細(xì)胞凍存3支/株，且3支確保有2個(gè)及以上凍存批次，避免出現(xiàn)凍存失誤，細(xì)胞株丟失）
使用到的NEST產(chǎn)品：
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無(wú)菌離心管 [NEST]
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標(biāo)板 [NEST]
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