動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)要流程
定義：
動(dòng)物細(xì)胞融合是指兩個(gè)或者多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后形成具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交瘤細(xì)胞。
動(dòng)物細(xì)胞融合通常有物理法（電刺激）、化學(xué)法（聚乙二醇）、生物法（滅活病毒）三種方法。而雜交瘤細(xì)胞是由經(jīng)免疫的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合而成的，既有無限增殖能力又能產(chǎn)生特定抗體能力的細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)材料：
DMEM高糖培養(yǎng)基
FBS/NBS
生物安全柜
滅菌手術(shù)剪刀、鑷子
HAT或HT選擇培養(yǎng)基
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱
雙抗（青鏈霉素混合液）
5mL一次性無菌注射器
單通道移液槍、多通道移液槍
低速離心機(jī)
倒置相差顯微鏡
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板[NEST]
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿[NEST]
200μL、1000μL吸頭[NEST]
220目（70μm）細(xì)胞篩[NEST]
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
飼養(yǎng)細(xì)胞：
融合前一天，取符合免疫質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的Balb/c小鼠，脫頸處死并泡在75%酒精中消毒。
用手術(shù)剪刀輕輕剪開老鼠的腹部皮膚。（注意請(qǐng)勿破壞小鼠的腹膜）取10mL DMEM培養(yǎng)基在50mL無菌離心管中， 5mL注射器吸取3~5mL培養(yǎng)基，用手術(shù)鑷子提起小鼠腹膜，將5ml培養(yǎng)基打入老鼠腹部，反復(fù)吹打3-4次后將培養(yǎng)基回收，置于50ml無菌離心管中。再次吸取5ml培養(yǎng)基，重復(fù)此步驟。在無菌條件下取出小鼠脾臟，用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網(wǎng)制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，再與腹腔細(xì)胞懸液混合，低速離心（1000rpm*10min），棄上清。使用HAT培養(yǎng)基重懸，制成飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，可按照105/孔使用，均勻鋪96孔板，每孔100μL。（在制備過程中嚴(yán)格保證無菌）SP2/0準(zhǔn)備：
SP2/0細(xì)胞在融合前4—5天復(fù)蘇，培養(yǎng)換液，使細(xì)胞在融合前狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。
試劑準(zhǔn)備：
取1mL/管50% PEG1450一支，DMEM，F(xiàn)BS-DMEM，F(xiàn)BS-DMEM(HAT)等試劑，均預(yù)熱置37℃
實(shí)驗(yàn)流程：
SP2/0收集：
SP2/0低速離心（1000rpm*5min），棄上清，用DMEM復(fù)懸清洗，再重復(fù)一次此步驟，37℃復(fù)懸備用。
脾細(xì)胞懸液制備：
取免疫完成的小鼠，眼球取血后，浸潤(rùn)在75%的酒精中消毒滅菌。在無菌條件下取出其脾臟，使用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網(wǎng)制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，用DMEM清洗并再一次重復(fù)此步驟，37℃復(fù)懸備用。
細(xì)胞融合：
將脾細(xì)胞和SP2/0按照[脾細(xì)胞：SP2/0 = 2:1~3:1]的比例，混合于50ml離心管中低速離心（1000rpm*10min），棄上清且確保管內(nèi)無液體殘留，將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕敲散，使脾細(xì)胞 & SP2/0在管底均勻混合鋪開。加入預(yù)熱完成的50% PEG1450 ，在1min內(nèi)逐滴均勻加入，加完后37℃反應(yīng)1min，反應(yīng)完成后加入10~15ml左右終止液（DMEM）終止反應(yīng)，由慢至快逐步滴加，10min全部加入完成。
融合鋪板：
細(xì)胞融合完成后，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，使用FBS-DMEM(HAT)復(fù)懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，（過程中注意動(dòng)作輕柔，不可用力吹打，以免破壞融合細(xì)胞降低融合率）。將提前一天已加入飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板取出，用吸頭將板內(nèi)培養(yǎng)基上清全部吸出丟棄，將剛制備完成的細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，轉(zhuǎn)入5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。
融合換液：
融合細(xì)胞在FBS-DMEM(HAT)中培養(yǎng)3~7天，根據(jù)細(xì)胞融合情況，將培養(yǎng)上清吸出丟棄，更換成FBS-DMEM(HT)，每孔200μL。換液后觀察細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在4~7天后用Elisa進(jìn)行融合陽(yáng)性篩選檢測(cè)。
附：可使用到的耐思產(chǎn)品
細(xì)胞培養(yǎng)板
移液吸頭
微量離心管
細(xì)胞培養(yǎng)皿
細(xì)胞篩
