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高通量測(cè)序后的下游實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法之m6A RNA甲基化篇

瀏覽次數(shù)：576　發(fā)布日期：2023-3-7　 來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
此前，我們分享了m6A RNA甲基化研究的數(shù)據(jù)挖掘思路，進(jìn)而篩選出m6A修飾目標(biāo)基因。

做完MeRIP-seq測(cè)序后，如果需要對(duì)分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證，則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。m6A RNA甲基化修飾目標(biāo)基因的進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)包括以下6個(gè)方面：
  1. 簡(jiǎn)單驗(yàn)證
  2. 全局m6A甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證m6A甲基化書(shū)否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
  3. 靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
  4. 研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
  5. m6A修飾目標(biāo)基因的表達(dá)回復(fù)實(shí)驗(yàn)
  6. 研究特定m6A Readers通過(guò)結(jié)合目標(biāo)基因RNA而影響目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)
 
（1）簡(jiǎn)單驗(yàn)證
A. 目標(biāo)基因m6A甲基化的驗(yàn)證：MeRIP-RT-PCR
B. 檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
C. 檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot

（2）全局m6A甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證m6A甲基化書(shū)否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
A. m6A甲基化干擾：m6A writers/erasers的突變/敲降/敲除/過(guò)表達(dá)、m6A甲基化抑制劑
如環(huán)亮氨酸、m6A去甲基化抑制劑如FTO抑制劑FB23-2
B. 檢測(cè)m6A甲基化整體變化：m6A甲基化免疫熒光染色（定性）、m6A斑點(diǎn)雜交（定性）、比色法（定量）、質(zhì)譜法（定量）
C. 檢測(cè)目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
D. 檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
F. 檢測(cè)細(xì)胞功能/表型變化
FB23-2給藥后，大腦損傷組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分顯著變差
 
（3）靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
A. 目的基因m6A甲基化干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)（Luciferase activity assay）——構(gòu)建含甲基化/未甲基化m6A位點(diǎn)的目標(biāo)基因-熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)。
B. 檢測(cè)目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
C. 檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
D. 檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
E. 檢測(cè)細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測(cè)定... ...
 


用于驗(yàn)證目標(biāo)基因上m6A甲基化功能的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

（4）研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
A. 檢測(cè)m6A是否通過(guò)影響目標(biāo)基因翻譯而影響蛋白質(zhì)水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通過(guò)對(duì)結(jié)合核糖體上的mRNA進(jìn)行定量，分析目標(biāo)基因的蛋白翻譯效率
通過(guò)對(duì)結(jié)合核糖體上的mRNA進(jìn)行定量，分析目標(biāo)基因的蛋白翻譯效率
 

Polysome Profiling方法舉例：


siMETTL3/14對(duì)目標(biāo)基因與與核糖體的結(jié)合造成影響，對(duì)內(nèi)參基因GAPDH無(wú)影響。
 
B. 研究m6A是否通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和降解而影響目標(biāo)基因蛋白水平
研究m6A對(duì)目標(biāo)基因mRNA水平的影響
RT-qPCR
RNA-seq
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR和RNA-seq檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA水平是否收到影響
 
C. 研究m6A是否通過(guò)調(diào)控RNA的出核（nuclear export）而影響目標(biāo)基因蛋白水平
裂解細(xì)胞，超速離心分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，然后分別進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平
 
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平是否受到影響

（5）m6A修飾目標(biāo)基因的表達(dá)回復(fù)實(shí)驗(yàn)
A.  writers的突變/敲降/敲除實(shí)驗(yàn)：
RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA水平變化
Western blot檢測(cè)目標(biāo)基因的蛋白水平變化
檢測(cè)目標(biāo)基因的功能
 
B.  writers的突變/敲降/敲除后，目標(biāo)基因的過(guò)表達(dá)回復(fù)實(shí)驗(yàn)：
檢測(cè)各項(xiàng)表型指數(shù)、細(xì)胞增殖、分化的回復(fù)情況
 


METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表達(dá)受到影響。而靶基因Ezh2過(guò)表達(dá)回復(fù)實(shí)驗(yàn)會(huì)消除METTL3敲除對(duì)細(xì)胞增殖分化的不利影響
 
（6）研究特定m6A Readers通過(guò)結(jié)合目標(biāo)基因RNA而影響目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)
  1. 合理推測(cè)結(jié)合目標(biāo)基因的m6A Readers是哪一種
  2. Readers的突變/敲降/敲除/過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)：
  3. 驗(yàn)證靶基因的mRNA水平
Western blot驗(yàn)證靶基因的蛋白水平
  • 的RIP-qPCR驗(yàn)證Readers蛋白與靶基因mRNA的結(jié)合
 


YTHDF1引入突變后，檢測(cè)其假定靶基因的表達(dá)和與靶基因的結(jié)合是否受到影響
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