詳解蛋白質質譜鑒定技術原理和方法
質譜分析技術有著高靈敏度，高精準度等特點，能夠準確快速地鑒定蛋白質。傳統(tǒng)的質譜技術僅限于小分析物質的分析，隨著新的離子化技術的出現(xiàn)和發(fā)展，如基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質譜（ESI-MS）等，為準確快速鑒定蛋白質等大分子提供了便捷的條件。目前，酶切蛋白質，液相色譜分離肽段，串聯(lián)質譜分析多肽氨基酸序列，聯(lián)合質譜數據分析已成為了鑒定蛋白質的首選方案。本文主要講下蛋白質譜鑒定的原理和應用。
一、MALDI-TOF基質輔助激光解吸附質譜技術（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight, MALDI-TOF）的基本原理是將分析物分散在基質分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹并進入氣相。MALDI所產生的質譜圖多為單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的質量有一一對應關系。MALDI產生的離子常用飛行時間（TOF）檢測器來檢測， 理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的， 因此MALDI-TOF質譜很適合對蛋白質、多肽等生物大分子的研究。
MALDI-TOF-MS分析
技術特點
• MALDI-TOF 鑒定方便、快速，可以同時做上百個斑點
• 主要用于純蛋白或簡單樣本的鑒定，如2DE斑點
• 成本較低
樣品要求
• 蛋白質溶液：純度> 90%；蛋白質總量> 5 ug，濃度> 0.1 ug/ul
• 雙向凝膠電泳點：考染、銀染點清晰可見
• SDS-PAGE膠條：單一蛋白質，考染、銀染條帶清晰可見
電噴霧電離質譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子而不是碎片離子，使質量電荷比降低到多數質量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電荷數算出。
解蛋白質質譜鑒定技術原理和方法
技術特點• 高通量：一次可鑒定數十至數百種蛋白質
• 靈敏度高：可檢測樣品濃度極低的膠點
• 通用性強：可分析蛋白質條帶、免疫共沉淀洗脫液、組織提取液、全細胞裂解液、亞細胞分離組分等多種形式的樣品
• 蛋白質溶液：蛋白質總量>5 ug，濃度>0.1 ug/ul。緩沖液中不含去污劑NP40、Triton X-100等。
• SDS-PAGE膠條：考染、銀染條帶清晰可見。
• 樣本制備過程應避免各類污染和反復凍融
• 配膠和切膠避免角蛋白污染，配膠試劑專用，切膠刀具使用干凈一次性的
• 蛋白考染，一般肉眼可見的量都是可以被質譜鑒定到的
• 銀染的蛋白質不能使用戊二醛作為固定劑，因為戊二醛使蛋白質發(fā)生不可逆交聯(lián)，會影響質譜鑒定結果
1. 蛋白質純度分析以及分子量測定
MALDI-TOF是一種軟電離技術，可用于檢測目標蛋白或多肽是否存在,有無二聚體存在,以及進行純度情況的大體評估。MALDI-TOF鑒定分子量范圍也非常廣，能夠鑒定700-60000Da的蛋白分子量，準確度高達0.1%~0.01%，遠遠高于目前常規(guī)應用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術。
2. 蛋白指紋譜鑒定（PMF）
肽質量指紋譜（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白質被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的肽片段的質量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列（一級結構）都不同，當蛋白被水解后，產生的肽片段序列也各不相同，因此其肽質量指紋圖也具有特征性。將肽譜圖與數據庫中蛋白質理論太譜圖對比，從而鑒定蛋白質的身份。因此，分子質量的精確度是PMF的關鍵指標所在，但蛋白質的翻譯后修飾可能使PMF的質量數與理論值不符，從而對蛋白鑒定的準確度有一定影響。
3. MS/MS串聯(lián)質譜法測序
串聯(lián)質譜法(MS/MS)，是目前常用的質譜鑒定方式。MS/MS先通過一級質譜測定肽段質量，再選取豐度高的肽段進行二級質譜分析，在二級質譜中肽段相互碰撞導致氨基酸鍵斷裂，產生肽段碎片離子經由檢測器分析，從而得到篩選肽段的氨基酸序列信息。MS/MS利用豐富肽段碎片的精確質量信息，更具有特異性、可信度，極大地增加了數據庫檢索的可靠性。
百泰派克技術平臺
檢測分析平臺：多臺高分辨率質譜儀、高效液相色譜、氣相色譜，NMR。
蛋白質組分析平臺：Label-free、iTRAQ、SILAC、SWATH、MRM；蛋白質定性定量鑒定、蛋白質差異分析、發(fā)現(xiàn)疾病標記物、發(fā)現(xiàn)藥物靶標。
代謝組分析平臺：靶向代謝組學、非靶向代謝組學、脂質組學分析；通量達1000種代謝分子、代謝通路分析、代謝靶標鑒定。流式細胞多因子檢測平臺：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細胞因子。
蛋白質從頭測序平臺：Obitrap Fusion Lumos質譜儀、PEAKS軟件分析；100%序列測定，精準蛋白、抗體測序。
生物制藥分析平臺：生物藥物鑒定、變異性分析、純度分析。
流式細胞多因子檢測平臺：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細胞因子。
