蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定前樣品制備注意事項(xiàng)

隨著高分辨率質(zhì)譜儀分析技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的方法已經(jīng)相當(dāng)純熟，一次性鑒定多個(gè)蛋白樣品，以及低豐度蛋白樣品已經(jīng)不再是難事。但是因?yàn)橘|(zhì)譜的靈敏度高，外來(lái)引入的蛋白質(zhì)可能會(huì)造成質(zhì)譜鑒定的假陽(yáng)性，因此，在蛋白樣品的準(zhǔn)備過程中要注意避免引入外來(lái)蛋白污染物。另外，蛋白樣品的準(zhǔn)備也需要使用與質(zhì)譜儀檢測(cè)兼容的溶液和試劑，這樣可以極大提高質(zhì)譜儀鑒定的準(zhǔn)確度。在這期小編就來(lái)給大家介紹蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定前的樣品準(zhǔn)備注意事項(xiàng)。

蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析一般流程

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的一般流程
1. 首先對(duì)細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行破碎，破碎的方法有很多種。大多數(shù)細(xì)胞可以通過選用常用的細(xì)胞裂解試劑，例如RIPA buffer，添加蛋白酶抑制劑和還原劑，來(lái)裂解細(xì)胞。組織則可以通過低溫勻漿，液氮冷凍研磨等方法破碎組織細(xì)胞。
2. 接著12，000 rpm，4度高速離心10分鐘，去除不可溶的細(xì)胞組分
3. 液體蛋白樣品可以使用抗體進(jìn)行富集，提純，以及IP處理，再濃縮待檢測(cè)的蛋白；也可以使用1D/2D-PAGE gel分離蛋白。
4. 濃縮后的液體蛋白經(jīng)過酶切后，再使用LC-MS/MS分析；蛋白膠樣則需要切下與目的蛋白分子量一致的蛋白條帶，再對(duì)蛋白進(jìn)行in-gel酶切和質(zhì)譜檢測(cè)分析。
5. 對(duì)質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析獲得可信度高的蛋白肽段序列，再與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得蛋白質(zhì)ID

細(xì)胞樣品：動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞，真菌和細(xì)菌等微生物細(xì)胞

組織樣品：動(dòng)物組織，植物組織

體液樣品：血清、血漿、尿液等

4.1. 濃縮樣品:

蛋白質(zhì)樣品可以用沉淀，膜分離，分離柱，冷凍干燥等各種方式進(jìn)行濃縮， 用戶應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)選擇合適的方法共列，用SDS樣品液可以從色譜樣上中洗脫蛋白，從而保持樣本體積小。
4.2. 電泳凝膠:

對(duì)于SDS- PAGE，傳統(tǒng)的Laemmli式，三甘氨酸凝膠及其各種改進(jìn)型的凝膠，如二，三凝膠或三鹽酸凝膠， 都可以兼容于蛋白質(zhì)鑒定。各種凝膠濃度也沒有限制。用戶選擇凝膠的類型和濃度液，應(yīng)根據(jù)對(duì)樣本的分離效果好來(lái)決定。
4.3. 蛋白膠染色：
• Coomassie Blue, SYPRO Ruby 以及Silver stain樣品均可進(jìn)行蛋白的鑒定試驗(yàn)；
• 銀染的樣品有可能與后續(xù)的質(zhì)譜分析不兼容，我們推薦您使用下面的產(chǎn)品或者實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行銀染實(shí)驗(yàn)：

ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)

Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)
• 另外，銀染的樣品請(qǐng)不要進(jìn)行脫色處理
4.4. 液體樣品：

樣品準(zhǔn)備過程中盡量減少SDS等表面活性劑的使用，并注意降低鹽濃度。如果您提交IP洗脫樣品，我們推薦使用HPH EB (0.5 M NH4OH, 0.5 mM EDTA) 緩沖體系進(jìn)行l(wèi)ast step蛋白的洗脫，保證洗脫緩沖體系與后續(xù)的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)兼容。
4.5. 切割蛋白帶:

凝膠在切割過程中應(yīng)避免與手，燈箱， 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接觸。在切割蛋白膠帶適應(yīng)盡量避免割下空白凝膠（它可能會(huì)降低酶切的消化效率和多肽的回收率）。 將每個(gè)凝膠帶置于干凈的，1.5毫升的微型離心管并給每個(gè)樣本小心地做上標(biāo)簽。

百泰派克技術(shù)平臺(tái)

檢測(cè)分析平臺(tái)：多臺(tái)高分辨率質(zhì)譜儀、高效液相色譜、氣相色譜，NMR。

蛋白質(zhì)組分析平臺(tái)：Label-free、iTRAQ、SILAC、SWATH、MRM；蛋白質(zhì)定性定量鑒定、蛋白質(zhì)差異分析、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)記物、發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)。

代謝組分析平臺(tái)：靶向代謝組學(xué)、非靶向代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)分析；通量達(dá)1000種代謝分子、代謝通路分析、代謝靶標(biāo)鑒定。流式細(xì)胞多因子檢測(cè)平臺(tái)：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細(xì)胞因子。

蛋白質(zhì)從頭測(cè)序平臺(tái)：Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀、PEAKS軟件分析；100%序列測(cè)定，精準(zhǔn)蛋白、抗體測(cè)序。

生物制藥分析平臺(tái)：生物藥物鑒定、變異性分析、純度分析。

流式細(xì)胞多因子檢測(cè)平臺(tái)：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細(xì)胞因子。