基于cfDNA甲基化的腫瘤液體活檢開展步驟
液體活檢是指通過微創(chuàng)或無創(chuàng)的方式收集血液或其他體液（包括尿液、腹水、胸腔積液等），并對其中腫瘤相關(guān)的物質(zhì)進行分析的一種檢驗方式。以血液為例，除了正常的紅細胞、白細胞、來自正常細胞的游離 DNA (cell free DNA, cfDNA)，還可以檢測到一些來自腫瘤的物質(zhì)，包括循環(huán)腫瘤細胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)、循環(huán)腫瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)。需要指出的是，cfDNA 可以來自正常細胞和腫瘤細胞，ctDNA 特指來自腫瘤的游離 DNA。
液體活檢，特別是對cfDNA的分析，已經(jīng)成為腫瘤學(xué)中一種具有廣闊應(yīng)用前景的非侵入性診斷方法。ctDNA甲基化可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測到，而且具有較好的穩(wěn)定性，因此ctDNA甲基化成為腫瘤液體活檢中一個極具價值的標(biāo)志物。目前正在開發(fā)cfDNA甲基化圖譜的系統(tǒng)分析，用于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、微小殘留病(MRD)的監(jiān)測、預(yù)測治療效果和預(yù)后、追蹤組織來源等。本文綜述了ctDNA圖譜在早期癌癥非侵入性診斷中的優(yōu)缺點，并探討了ctDNA甲基化檢測在臨床應(yīng)用中的最新進展。還總結(jié)了用于ctDNA甲基化分析的技術(shù)，并簡要概述了用于分析DNA甲基化測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)方法。
下面將從cfDNA和ctDNA的基本概念、ctDNA甲基化檢測技術(shù)、DNA甲基化數(shù)據(jù)分析模式以及ctDNA甲基化的臨床應(yīng)用這四個方面進行簡要概述。
1.什么是cfDNA和ctDNA？
cfDNA（cell free DNA）是指細胞游離DNA，通過細胞凋亡、壞死和分泌釋放到血液中(圖1)。cfDNA通常是雙鏈片段，長度約為150-200個堿基對。ctDNA的分子遺傳和表觀遺傳信息可以反映出起源細胞的基因組或表觀基因組。健康成年人的cfDNA濃度一般很低，通常不到每毫升血漿10微克。
在癌癥患者中，總cfDNA的某些成分是由腫瘤細胞釋放的，稱為ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整個cfDNA背景中的比例變化很大，從0.05%到90%不等。影響ctDNA濃度的因素很多，包括腫瘤的體積、定位和血運、抗腫瘤治療(如手術(shù)、化療、放療等)，以及肝和腎的清除作用。據(jù)報道，ctDNA的半衰期為16分鐘到2.5小時，這使得ctDNA分析可以作為腫瘤情況的“實時快照”。ctDNA在膀胱癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等癌癥類型中幾乎可以100%被檢測到，并且在其他大多數(shù)癌癥類型中也有超過50%的概率可以被檢測到，不過在膠質(zhì)瘤中只有10%的病例中可以檢測到ctDNA。同時，血漿中ctDNA濃度和可檢測到ctDNA水平也被證明與腫瘤分期有關(guān)。
2.ctDNA甲基化檢測技術(shù)
在將ctDNA甲基化分析應(yīng)用于臨床之前，需要解決的關(guān)鍵問題之一是檢測技術(shù)，它必須具有高靈敏度、成本效益和測序覆蓋率高的特點，特別是對于非常微量的ctDNA。目前，已經(jīng)開發(fā)了許多檢測ctDNA甲基化的方法(圖2)，大致可分為兩類：基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法和非重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法。表1選擇性地列出了當(dāng)前主要檢測方法的優(yōu)缺點和對cfDNA起始量的需求。
其中，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法可以分為基因組甲基化檢測，代表性的方法包括全基因組甲基化測序（WGBS）和簡化基因組甲基化測序（RRBS等）。如果要檢測特定位點的甲基化，還可以使用靶基因重壓硫酸鹽測序（Target-BS）、焦磷酸測序、甲基化芯片和甲基化特異性PCR(MSP)。而不依賴于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法又可以分為基于富集的方法和基于限制性內(nèi)切酶的方法。表1列出了當(dāng)前主要檢測方法的優(yōu)缺點以及對cfDNA起始量的需求。
表1.液體活檢的主要甲基化檢測方法
3.DNA甲基化數(shù)據(jù)分析模式
ctDNA技術(shù)的最新發(fā)展側(cè)重于提高測序方法的分析靈敏度，這可能會受到DNA制備過程中或測序過程中引入的錯誤的影響。ctDNA甲基化與常規(guī)數(shù)據(jù)分析在分析策略上沒有明顯差異。對于基于NGS的方法，分析程序包括質(zhì)量控制(QC)、數(shù)據(jù)比對、DNA甲基化位點/甲基化峰確認、DNA甲基化定量和差異甲基化位點/區(qū)域(DMS/DMR)鑒定。結(jié)合測序文庫的準(zhǔn)備，每種測量方法對應(yīng)的分析細節(jié)在某些步驟上是不同的，下面介紹常用的分析程序：
質(zhì)量控制(QC)和數(shù)據(jù)比對：即對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，保留高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與人類參考基因組進行比對。
定量DNA甲基化位點/峰：對于亞硫酸氫鹽測序方法，甲基化位點由比對中未改變的C位點決定，獲得的每個CpG位點的甲基化水平是一個連續(xù)變量，通過使用未甲基化的C在測序的總C中的比例來計算。
差異甲基化位點/區(qū)域(DMS/DMR)鑒定：在進行回歸分析時，可以添加協(xié)變量校正以消除混雜因素的影響，如年齡和性別。在小樣本量的情況下，多個相鄰的CpG位點應(yīng)合并到一個定義的區(qū)域，稱為DMR，以提高統(tǒng)計性能。
癌癥特異性cfDNA甲基化生物標(biāo)志物的鑒定：通常的步驟是(i)獲得癌癥和健康cfDNA之間的DMRs；(ii)獲得癌癥cfDNA和外周血單核細胞(PBMC)基因組DNA的DMRs；(iii)前述DMRs的共有區(qū)域為腫瘤特異性DMRs，同時將無腫瘤PBMC的甲基化譜作為陰性對照。
4. ctDNA甲基化的臨床應(yīng)用場景
ctDNA甲基化在精確腫瘤學(xué)中的臨床應(yīng)用場景主要有以下幾個方面：
癌癥篩查：篩查疾病標(biāo)志物，以便對無癥狀個體的癌癥進行早期干預(yù)。
癌癥檢測：癌癥的早期檢測可以使治療盡早開始。如果腫瘤被早期診斷，可以進行根治性手術(shù)，以提高患者的治愈率。對于有癥狀的患者，靈敏而特異的癌癥檢測可以加快診斷和治療的時間。
微小殘留病和復(fù)發(fā)監(jiān)測：識別復(fù)發(fā)風(fēng)險高的殘留病患者，這可用于在接受輔助治療之前對患者進行分級。有效的分級將防止低風(fēng)險患者過度治療，防止高危患者治療不足。MRD可以比目前的方法提前幾個月預(yù)測復(fù)發(fā)。
評估治療效果：ctDNA動態(tài)與治療反應(yīng)相關(guān)，能夠在臨床復(fù)發(fā)前提示治療效果。治療監(jiān)測可以確定反應(yīng)或進展，使臨床醫(yī)生和患者能夠相應(yīng)地選擇治療方案。
預(yù)后價值：對進展風(fēng)險的評估對于治療策略的選擇至關(guān)重要。
追蹤ctDNA的組織來源：確定cfDNA的組織來源具有重大的生物學(xué)意義和潛在診斷價值。
下表列舉了近期基于DNA甲基化的癌癥液體活檢研究的部分綜述，感興趣的小伙伴也可檢索文獻閱讀。
總體而言，ctDNA 甲基化是腫瘤早期或復(fù)發(fā)早期的重要信號，檢測體液中的ctDNA 甲基化對于腫瘤的篩查、早期診斷、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)檢測、療效評估等關(guān)鍵難題極具應(yīng)用價值。
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.12.01
液體活檢，特別是對cfDNA的分析，已經(jīng)成為腫瘤學(xué)中一種具有廣闊應(yīng)用前景的非侵入性診斷方法。ctDNA甲基化可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測到，而且具有較好的穩(wěn)定性，因此ctDNA甲基化成為腫瘤液體活檢中一個極具價值的標(biāo)志物。目前正在開發(fā)cfDNA甲基化圖譜的系統(tǒng)分析，用于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、微小殘留病(MRD)的監(jiān)測、預(yù)測治療效果和預(yù)后、追蹤組織來源等。本文綜述了ctDNA圖譜在早期癌癥非侵入性診斷中的優(yōu)缺點，并探討了ctDNA甲基化檢測在臨床應(yīng)用中的最新進展。還總結(jié)了用于ctDNA甲基化分析的技術(shù)，并簡要概述了用于分析DNA甲基化測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)方法。
下面將從cfDNA和ctDNA的基本概念、ctDNA甲基化檢測技術(shù)、DNA甲基化數(shù)據(jù)分析模式以及ctDNA甲基化的臨床應(yīng)用這四個方面進行簡要概述。
1.什么是cfDNA和ctDNA？
cfDNA（cell free DNA）是指細胞游離DNA，通過細胞凋亡、壞死和分泌釋放到血液中(圖1)。cfDNA通常是雙鏈片段，長度約為150-200個堿基對。ctDNA的分子遺傳和表觀遺傳信息可以反映出起源細胞的基因組或表觀基因組。健康成年人的cfDNA濃度一般很低，通常不到每毫升血漿10微克。
在癌癥患者中，總cfDNA的某些成分是由腫瘤細胞釋放的，稱為ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整個cfDNA背景中的比例變化很大，從0.05%到90%不等。影響ctDNA濃度的因素很多，包括腫瘤的體積、定位和血運、抗腫瘤治療(如手術(shù)、化療、放療等)，以及肝和腎的清除作用。據(jù)報道，ctDNA的半衰期為16分鐘到2.5小時，這使得ctDNA分析可以作為腫瘤情況的“實時快照”。ctDNA在膀胱癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等癌癥類型中幾乎可以100%被檢測到，并且在其他大多數(shù)癌癥類型中也有超過50%的概率可以被檢測到，不過在膠質(zhì)瘤中只有10%的病例中可以檢測到ctDNA。同時，血漿中ctDNA濃度和可檢測到ctDNA水平也被證明與腫瘤分期有關(guān)。
圖1
2.ctDNA甲基化檢測技術(shù)
在將ctDNA甲基化分析應(yīng)用于臨床之前，需要解決的關(guān)鍵問題之一是檢測技術(shù)，它必須具有高靈敏度、成本效益和測序覆蓋率高的特點，特別是對于非常微量的ctDNA。目前，已經(jīng)開發(fā)了許多檢測ctDNA甲基化的方法(圖2)，大致可分為兩類：基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法和非重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法。表1選擇性地列出了當(dāng)前主要檢測方法的優(yōu)缺點和對cfDNA起始量的需求。
圖2
其中，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法可以分為基因組甲基化檢測，代表性的方法包括全基因組甲基化測序（WGBS）和簡化基因組甲基化測序（RRBS等）。如果要檢測特定位點的甲基化，還可以使用靶基因重壓硫酸鹽測序（Target-BS）、焦磷酸測序、甲基化芯片和甲基化特異性PCR(MSP)。而不依賴于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法又可以分為基于富集的方法和基于限制性內(nèi)切酶的方法。表1列出了當(dāng)前主要檢測方法的優(yōu)缺點以及對cfDNA起始量的需求。
表1.液體活檢的主要甲基化檢測方法
3.DNA甲基化數(shù)據(jù)分析模式
ctDNA技術(shù)的最新發(fā)展側(cè)重于提高測序方法的分析靈敏度，這可能會受到DNA制備過程中或測序過程中引入的錯誤的影響。ctDNA甲基化與常規(guī)數(shù)據(jù)分析在分析策略上沒有明顯差異。對于基于NGS的方法，分析程序包括質(zhì)量控制(QC)、數(shù)據(jù)比對、DNA甲基化位點/甲基化峰確認、DNA甲基化定量和差異甲基化位點/區(qū)域(DMS/DMR)鑒定。結(jié)合測序文庫的準(zhǔn)備，每種測量方法對應(yīng)的分析細節(jié)在某些步驟上是不同的，下面介紹常用的分析程序：
質(zhì)量控制(QC)和數(shù)據(jù)比對：即對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，保留高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與人類參考基因組進行比對。
定量DNA甲基化位點/峰：對于亞硫酸氫鹽測序方法，甲基化位點由比對中未改變的C位點決定，獲得的每個CpG位點的甲基化水平是一個連續(xù)變量，通過使用未甲基化的C在測序的總C中的比例來計算。
差異甲基化位點/區(qū)域(DMS/DMR)鑒定：在進行回歸分析時，可以添加協(xié)變量校正以消除混雜因素的影響，如年齡和性別。在小樣本量的情況下，多個相鄰的CpG位點應(yīng)合并到一個定義的區(qū)域，稱為DMR，以提高統(tǒng)計性能。
癌癥特異性cfDNA甲基化生物標(biāo)志物的鑒定：通常的步驟是(i)獲得癌癥和健康cfDNA之間的DMRs；(ii)獲得癌癥cfDNA和外周血單核細胞(PBMC)基因組DNA的DMRs；(iii)前述DMRs的共有區(qū)域為腫瘤特異性DMRs，同時將無腫瘤PBMC的甲基化譜作為陰性對照。
4. ctDNA甲基化的臨床應(yīng)用場景
ctDNA甲基化在精確腫瘤學(xué)中的臨床應(yīng)用場景主要有以下幾個方面：
癌癥篩查：篩查疾病標(biāo)志物，以便對無癥狀個體的癌癥進行早期干預(yù)。
癌癥檢測：癌癥的早期檢測可以使治療盡早開始。如果腫瘤被早期診斷，可以進行根治性手術(shù)，以提高患者的治愈率。對于有癥狀的患者，靈敏而特異的癌癥檢測可以加快診斷和治療的時間。
微小殘留病和復(fù)發(fā)監(jiān)測：識別復(fù)發(fā)風(fēng)險高的殘留病患者，這可用于在接受輔助治療之前對患者進行分級。有效的分級將防止低風(fēng)險患者過度治療，防止高危患者治療不足。MRD可以比目前的方法提前幾個月預(yù)測復(fù)發(fā)。
評估治療效果：ctDNA動態(tài)與治療反應(yīng)相關(guān)，能夠在臨床復(fù)發(fā)前提示治療效果。治療監(jiān)測可以確定反應(yīng)或進展，使臨床醫(yī)生和患者能夠相應(yīng)地選擇治療方案。
預(yù)后價值：對進展風(fēng)險的評估對于治療策略的選擇至關(guān)重要。
追蹤ctDNA的組織來源：確定cfDNA的組織來源具有重大的生物學(xué)意義和潛在診斷價值。
下表列舉了近期基于DNA甲基化的癌癥液體活檢研究的部分綜述，感興趣的小伙伴也可檢索文獻閱讀。
總體而言，ctDNA 甲基化是腫瘤早期或復(fù)發(fā)早期的重要信號，檢測體液中的ctDNA 甲基化對于腫瘤的篩查、早期診斷、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)檢測、療效評估等關(guān)鍵難題極具應(yīng)用價值。
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.12.01
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