微量樣本RNA甲基化m6A技術的比較
在哺乳動物mRNA中，N6-甲基腺苷（m6A）約占所有腺苷的0.2％至0.6％，是豐度最高的mRNA修飾。RNA免疫沉淀后通過高通量測序（MeRIP-seq），是轉錄組范圍內檢測m6A修飾位置最為有力的技術方法。常規(guī)免疫沉淀富集需要上百微克的總RNA，這限制了其在許多領域的應用。微量MeRIP技術優(yōu)化實驗過程中的關鍵參數，包括RNA的起始量，RNA片段化，抗體選擇，MeRIP洗滌/洗脫條件，RNA文庫構建方法和生物信息學分析流程，實現最低500ng總RNA分析轉錄組m6A修飾分布。通過2個肺腺癌（ADC）患者樣本測試鑒定出大約12000個高信噪比（S/N）的m6A峰。通過對同一患者樣本分析轉錄組、表觀轉錄組和蛋白質組數據，從m6A水平解釋了該腫瘤mRNA表達和蛋白質翻譯水平差異的動力學原因。
研究現狀
表觀轉錄組學是基于RNA生物化學修飾的，影響轉錄組功能相關的表觀改變，是研究轉錄后基因表達調控的新方向。迄今為止，已發(fā)現150多種RNA修飾。自20世紀70年代第一次發(fā)現以來，N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳動物mRNA最豐富的修飾形式之一。近年來研究發(fā)現，m6A的修飾位點，功能和分子機制是可逆的，調控是動態(tài)控制的，調控RNA生命周期的多個環(huán)節(jié)，包括RNA剪接，RNA衰減，miRNA前體加工和蛋白質翻譯等。
研究發(fā)現mRNA動態(tài)m6A修飾與干細胞的分化和重編程，熱休克應激，DNA損傷應答，性發(fā)育以及生物鐘的速度密切相關。此外，最近的研究表明，m6A修飾紊亂與癌癥的起始和發(fā)展密切相關。m6A關鍵酶的表達，包括m6A形成酶（writers）、識別酶（readers）以及去除酶（erasers）均在多種腫瘤中發(fā)生改變。低氧誘導m6A去甲基化酶ALKBH5上調導致干細胞標記基因NANOG的mRNA去甲基，導致的NANOG表達升高，乳腺癌干細胞腫瘤形成能力增加。此外，ALKBH5通過增強FOXM1的mRNA表達，在膠質母細胞瘤增殖和腫瘤發(fā)生中也起著重要作用，FOXM1是膠質母細胞瘤干細胞自我更新的關鍵轉錄因子。同樣，m6A的脫甲基酶FTO和甲基轉移酶METTL3分別在急性骨髓性白血病和肺癌中顯示出致癌功能。
m6A RNA免疫沉淀后進行二代測序（m6A MeRIP-seq）可以在轉錄組范圍內鑒定m6A修飾。在人類細胞中，已鑒定出超過10000個m6A修飾位點分布在大約7000個蛋白質編碼基因和非編碼RNA的轉錄本中。盡管在過去的幾年中已經對該技術進行了數項改進，并且已有商業(yè)化m6A MeRIP試劑盒，RNA的起始量仍需要數百微克。這限制了m6A表觀轉錄組分析在臨床樣本中的應用。因此，盡管m6A是哺乳動物mRNA中最豐富的內部修飾，但是由于缺乏有效的分析方法，m6A修飾在人類疾病中的作用和動力學原因仍然知之甚少。以下通過優(yōu)化測試MeRIP不同實驗參數，包括RNA起始量、RNA片段化、抗體篩選、MeRIP洗滌/洗脫條件、RNA文庫構建方法，以及生信分析流程等，運用2ug的肺癌病人腫瘤組織總RNA，檢測到12000個高信噪比的m6A富集峰。
洗滌/洗脫條件的優(yōu)化
化學打斷是m6A MeRIP的第一個步驟。高溫可使m1A通過Dimroth重排轉化為m6A，RNA通過70℃而不是94℃片段化可盡可能降低m1A到m6A的重排轉化。此外，為了將RNA起始量降低至微克級別，運用總RNA代替富集后的mRNA進行片段化，并且RNA片段化范圍調整為200nt左右，降低樣本純化丟失。將RNA片段化在200nt的回收效率是100nt的近3倍。
圖1
目前MeRIP可概括為兩種主流技術流程。第一種流程如圖1A方法Ⅱ所示，免疫沉淀（IP）富集后，使用低/高鹽洗滌，最后洗脫整個抗體-磁珠復合體。第二種流程如圖1A方法Ⅲ所示，IP富集后，使用IP反應緩沖液洗滌，最后通過游離m6A競爭性洗脫m6A修飾RNA片段，這種方法在領域內應用廣泛。為了比較這兩種流程的IP效能，首先使用等量混合的m6A修飾對照RNA(GLuc)和未修飾對照RNA(CLuc)進行MeRIP實驗。 GLuc RNA對照是體外以20% m6ATP和80% ATP為底物的轉錄產物。圖1A中的方法Ⅰ作為外加對照，該對照使用NEB抗體，用IP反應緩沖液洗滌并洗脫整個抗體-磁珠復合物。方法Ⅱ使用低/高鹽洗滌，產生較高的信噪比（圖1B）。 方法Ⅱ中將洗脫的RNA進行兩輪IP反應，進一步提高了富集信噪比(圖1C)。進一步將32μg人肺癌細胞系A549的RNA樣品與0.1f mol的GLuc和CLuc RNA混合，使用方法II進行MeRIP富集，基于已發(fā)表數據，將SETD7和GAPDH分別作為陽性和陰性對照，單經一輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比都高達100倍左右 (圖1D和1E)。經過兩輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比進一步提升(圖1D和1E)，但是產率顯著降低約66%。
Anti-m6A抗體對m6A MeRIP效率影響對比
為進一步比較m6A抗體的保真度，選擇Synaptic Systems (SySy)，NEB和Millipore三個公司的抗體用于對比。每個IP富集的RNA投入量為32μg的A549細胞系總RNA混合0.1f mol的GLuc和CLuc RNA對照。SySy抗體富集RNA的產量是NEB或Millipore的兩倍。三種抗體富集，通過GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH測定的信噪比值均較高，而NEB和Millipore的比值均在100以上（圖2A）。
圖2
圖3
不同RNA起始量MeRIP-seq結果比較
使用Millipore抗體測試不同起始量總RNA (32ug、12ug、6ug、2ug、1ug和0.5ug)的m6A MeRIP效率。SETD7/GAPDH信噪比隨著總RNA起始量的減少而逐漸降低，重復性如0.5ug總RNA起始展示的，呈現較好（r=0.9）。提高RNA的起始量可相應增加m6A檢測峰的數量，除了0.5ug RNA外，檢測峰的數量均在20M左右的測序數據下達到平臺期，而0.5ug總RNA的富集在10M左右即到達平臺期（圖3A）。與2ug總RNA富集相比，32ug，12ug和6ug總RNA富集測序，隨著RNA起始量的提升，m6A唯一檢測峰的數量隨之增加（圖3B）。此外，在32ug起始RNA富集文庫中，m6A重疊檢測峰相關基因（N=1579）的平均表達水平顯著高于m6A唯一檢測峰相關基因（N=2168）的平均表達水平（圖3C），表明低豐度m6A修飾RNA峰可以通過增加RNA起始量通過MeRIP測序檢測出來。
2ug總RNA起始檢測到的終止密碼子附近m6A峰和m6A修飾核心基序特征與高起始RNA富集相似（圖3D）。2ug文庫數據特征也與300ug RNA常規(guī)富集對照數據相似。2ug總RNA分別使用5ug、1ug和0.2ug Millipore抗體進行富集，結果顯示降低抗體的量會升高信噪比，但是富集到的RNA產量也會降低。
參考文獻
1. ZengY,WangS,GaoS,SoaresF,Ahmed M,GuoH,etal.(2018) Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials.PLoSBiol16(9):e2006092.
2. Batista PJ. The RNA Modification N(6)-methyladenosine and Its Implications in Human Disease. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2017.
3. Yue Y, Liu J, He C. RNA N6-methyladenosine methylation in post-transcriptional gene expression regulation. Genes Dev. 2015; 29: 1343–1355.
研究現狀
表觀轉錄組學是基于RNA生物化學修飾的，影響轉錄組功能相關的表觀改變，是研究轉錄后基因表達調控的新方向。迄今為止，已發(fā)現150多種RNA修飾。自20世紀70年代第一次發(fā)現以來，N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳動物mRNA最豐富的修飾形式之一。近年來研究發(fā)現，m6A的修飾位點，功能和分子機制是可逆的，調控是動態(tài)控制的，調控RNA生命周期的多個環(huán)節(jié)，包括RNA剪接，RNA衰減，miRNA前體加工和蛋白質翻譯等。
研究發(fā)現mRNA動態(tài)m6A修飾與干細胞的分化和重編程，熱休克應激，DNA損傷應答，性發(fā)育以及生物鐘的速度密切相關。此外，最近的研究表明，m6A修飾紊亂與癌癥的起始和發(fā)展密切相關。m6A關鍵酶的表達，包括m6A形成酶（writers）、識別酶（readers）以及去除酶（erasers）均在多種腫瘤中發(fā)生改變。低氧誘導m6A去甲基化酶ALKBH5上調導致干細胞標記基因NANOG的mRNA去甲基，導致的NANOG表達升高，乳腺癌干細胞腫瘤形成能力增加。此外，ALKBH5通過增強FOXM1的mRNA表達，在膠質母細胞瘤增殖和腫瘤發(fā)生中也起著重要作用，FOXM1是膠質母細胞瘤干細胞自我更新的關鍵轉錄因子。同樣，m6A的脫甲基酶FTO和甲基轉移酶METTL3分別在急性骨髓性白血病和肺癌中顯示出致癌功能。
m6A RNA免疫沉淀后進行二代測序（m6A MeRIP-seq）可以在轉錄組范圍內鑒定m6A修飾。在人類細胞中，已鑒定出超過10000個m6A修飾位點分布在大約7000個蛋白質編碼基因和非編碼RNA的轉錄本中。盡管在過去的幾年中已經對該技術進行了數項改進，并且已有商業(yè)化m6A MeRIP試劑盒，RNA的起始量仍需要數百微克。這限制了m6A表觀轉錄組分析在臨床樣本中的應用。因此，盡管m6A是哺乳動物mRNA中最豐富的內部修飾，但是由于缺乏有效的分析方法，m6A修飾在人類疾病中的作用和動力學原因仍然知之甚少。以下通過優(yōu)化測試MeRIP不同實驗參數，包括RNA起始量、RNA片段化、抗體篩選、MeRIP洗滌/洗脫條件、RNA文庫構建方法，以及生信分析流程等，運用2ug的肺癌病人腫瘤組織總RNA，檢測到12000個高信噪比的m6A富集峰。
洗滌/洗脫條件的優(yōu)化
化學打斷是m6A MeRIP的第一個步驟。高溫可使m1A通過Dimroth重排轉化為m6A，RNA通過70℃而不是94℃片段化可盡可能降低m1A到m6A的重排轉化。此外，為了將RNA起始量降低至微克級別，運用總RNA代替富集后的mRNA進行片段化，并且RNA片段化范圍調整為200nt左右，降低樣本純化丟失。將RNA片段化在200nt的回收效率是100nt的近3倍。
圖1目前MeRIP可概括為兩種主流技術流程。第一種流程如圖1A方法Ⅱ所示，免疫沉淀（IP）富集后，使用低/高鹽洗滌，最后洗脫整個抗體-磁珠復合體。第二種流程如圖1A方法Ⅲ所示，IP富集后，使用IP反應緩沖液洗滌，最后通過游離m6A競爭性洗脫m6A修飾RNA片段，這種方法在領域內應用廣泛。為了比較這兩種流程的IP效能，首先使用等量混合的m6A修飾對照RNA(GLuc)和未修飾對照RNA(CLuc)進行MeRIP實驗。 GLuc RNA對照是體外以20% m6ATP和80% ATP為底物的轉錄產物。圖1A中的方法Ⅰ作為外加對照，該對照使用NEB抗體，用IP反應緩沖液洗滌并洗脫整個抗體-磁珠復合物。方法Ⅱ使用低/高鹽洗滌，產生較高的信噪比（圖1B）。 方法Ⅱ中將洗脫的RNA進行兩輪IP反應，進一步提高了富集信噪比(圖1C)。進一步將32μg人肺癌細胞系A549的RNA樣品與0.1f mol的GLuc和CLuc RNA混合，使用方法II進行MeRIP富集，基于已發(fā)表數據，將SETD7和GAPDH分別作為陽性和陰性對照，單經一輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比都高達100倍左右 (圖1D和1E)。經過兩輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比進一步提升(圖1D和1E)，但是產率顯著降低約66%。
Anti-m6A抗體對m6A MeRIP效率影響對比
為進一步比較m6A抗體的保真度，選擇Synaptic Systems (SySy)，NEB和Millipore三個公司的抗體用于對比。每個IP富集的RNA投入量為32μg的A549細胞系總RNA混合0.1f mol的GLuc和CLuc RNA對照。SySy抗體富集RNA的產量是NEB或Millipore的兩倍。三種抗體富集，通過GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH測定的信噪比值均較高，而NEB和Millipore的比值均在100以上（圖2A）。
圖2
IP富集RNA建庫試劑盒選取
分析市面上RNA測序文庫制備試劑盒后，選用Takara/Clontech公司的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)用于文庫構建。該試劑盒使用針對哺乳動物rRNA逆轉錄和擴增后cDNA的特異性探針去除核糖體cDNA，極大降低了低起始量RNA片段化前，直接進行rRNA去除或poly(A) 尾富集過程中的RNA丟失。該試劑盒成功用于上述三種抗體IP富集RNA和input RNA的文庫構建。三種抗體富集測序數據中，SETD7基因轉錄本的信噪比趨勢跟RT-QPCR結果相一致（圖2B）。每個文庫大約檢測到13000個m6A峰，每個基因平均有3個峰。約60%的m6A峰在3種抗體富集文庫中重疊（圖2C）。3種抗體富集文庫測序數據量達到20 M的Reads時，檢測峰的數量達到平臺期（圖2D）。m6A峰主要分布在轉錄本的終止密碼子附近。3種抗體m6A富集在5種基因組元件中的比例相似（圖2E），m6A信號在終止密碼子附近富集（圖2F）。此外，Millipore和NEB抗體m6A富集具有“GGAC”基序特征（圖2G）。另外，32ug起始RNA文庫數據與300ug總RNA起始的m6A文庫數據相當。
圖3不同RNA起始量MeRIP-seq結果比較
使用Millipore抗體測試不同起始量總RNA (32ug、12ug、6ug、2ug、1ug和0.5ug)的m6A MeRIP效率。SETD7/GAPDH信噪比隨著總RNA起始量的減少而逐漸降低，重復性如0.5ug總RNA起始展示的，呈現較好（r=0.9）。提高RNA的起始量可相應增加m6A檢測峰的數量，除了0.5ug RNA外，檢測峰的數量均在20M左右的測序數據下達到平臺期，而0.5ug總RNA的富集在10M左右即到達平臺期（圖3A）。與2ug總RNA富集相比，32ug，12ug和6ug總RNA富集測序，隨著RNA起始量的提升，m6A唯一檢測峰的數量隨之增加（圖3B）。此外，在32ug起始RNA富集文庫中，m6A重疊檢測峰相關基因（N=1579）的平均表達水平顯著高于m6A唯一檢測峰相關基因（N=2168）的平均表達水平（圖3C），表明低豐度m6A修飾RNA峰可以通過增加RNA起始量通過MeRIP測序檢測出來。
2ug總RNA起始檢測到的終止密碼子附近m6A峰和m6A修飾核心基序特征與高起始RNA富集相似（圖3D）。2ug文庫數據特征也與300ug RNA常規(guī)富集對照數據相似。2ug總RNA分別使用5ug、1ug和0.2ug Millipore抗體進行富集，結果顯示降低抗體的量會升高信噪比，但是富集到的RNA產量也會降低。
參考文獻
1. ZengY,WangS,GaoS,SoaresF,Ahmed M,GuoH,etal.(2018) Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials.PLoSBiol16(9):e2006092.
2. Batista PJ. The RNA Modification N(6)-methyladenosine and Its Implications in Human Disease. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2017.
3. Yue Y, Liu J, He C. RNA N6-methyladenosine methylation in post-transcriptional gene expression regulation. Genes Dev. 2015; 29: 1343–1355.
