全基因組CpG密度和DNA甲基化分析方法MeDIP、RRBS和WGBS的比較
CpG密度（CpG density）與各種組織中的DNA甲基化相關(guān)�；蚪M按CpG密度分為：CpG島（CpG island，CGI）、CpG島上下游2kb以內(nèi)的區(qū)域（CpG shore ，CpG島岸）、CpG島岸上下游2kb以內(nèi)的區(qū)域（CpG shelve，CpG大陸架），一共5個區(qū)域，分別統(tǒng)計各區(qū)域的甲基化水平。
全基因組DNA甲基化分析是用于基因組表征和差異DNA甲基化分析的最常見表觀遺傳學(xué)過程之一。先前的全基因組分析表明，CpG密度是DNA甲基化方法中的一個重要變量。目前的研究旨在分析各種不同物種基因組中的CpG密度，并將其與各種DNA甲基化分析數(shù)據(jù)集進行關(guān)聯(lián)分析。對人、大鼠、鳥類、魚類的基因組中觀察到類似的結(jié)果：90%以上的基因組區(qū)域?qū)儆诘兔芏阮悇e（1-3 CpG/100bp），小于10%的基因組區(qū)域?qū)儆诟呙芏阮悇e（>5 CpG/100bp）。甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）使用抗5-甲基胞嘧啶抗體免疫沉淀，然后進行下一代測序（MeDIP-Seq），MeDIP偏好<5 CpG/100bp的低CpG密度（對應(yīng)>95%的基因組）。減少代表性重亞硫酸鹽測序（RRBS）通常在≥3CpG/100bp的較高CpG密度區(qū)域中鑒定DMR（對應(yīng)約20%的基因組）。全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）在通常大于10 CpG/100bp更高的CpG密度區(qū)域分析，且WGBS可鑒定≥2 CpG/100bp區(qū)域（約占基因組50%）。CpG密度是DNA甲基化分析中的關(guān)鍵變量，不同分子技術(shù)專注于不同的基因組區(qū)域，本文比較了MeDIP-Seq、RRBS、WGBS三種DNA甲基化分析方法。
比較方法
MeDIP-seq、RRBS、WGBS每種技術(shù)均從目標(biāo)細(xì)胞類型或組織的DNA提取和純化開始。
MeDIP-seq將DNA超聲處理成幾百個堿基對的短片段，產(chǎn)生單鏈DNA以實現(xiàn)有效的抗體結(jié)合，然后使用5-甲基胞嘧啶抗體結(jié)合包含甲基化CpG位點的片段。這些片段通常用結(jié)合抗體的磁珠分離，并用PCR擴增DNA后測序。PCR包括通用引物和索引引物以及條形碼引物，以擴增所有DNA片段。MeDIP-seq的局限在于無法達到單堿基分辨率，不是高通量測序，不能鑒定單個CpG甲基化水平和高密度的CpG位點。
基于亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的RRBS和WGBS是可以達到單堿基分辨率的高通量DNA甲基化測序方法。
RRBS使用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化，在高GC密度CpG位點將未甲基化的DNA酶切成片段。對這些片段進一步處理并選擇大小并靶向啟動子和CpG島區(qū)域，所得片段進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，同時保留未轉(zhuǎn)化的甲基化胞嘧啶，隨后對片段進行PCR擴增并測序。
WGBS對全基因組進行亞硫酸鹽處理和分析，在亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化之前不進行甲基化片段分離。對亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的全基因組甲基化進行測序，并使用各種生物信息學(xué)方案，通常用于基因組表征。
比較結(jié)果
在人、大鼠、魚（斑馬魚和鋼頭鱒魚）和鳥類（雞）基因組中研究了全基因組CpG密度分布。從NCBI或Ensembl獲得參考基因組序列，初步分析1000bp窗口鑒定全基因組CpG密度�；蚪M主要由<3 CpG/100bp的CpG密度較低區(qū)域組成，小部分基因組位點的CpG密度較高。在所有不同物種的基因組中觀察到類似結(jié)果。在<3 CpG/100 bp的基因組區(qū)域中，對應(yīng)于97%的人基因組、98%的大鼠基因組、88%的斑馬魚基因組、93%的鋼頭鱒魚基因組、94%的雞基因組�；蚪M中很少有1kb區(qū)域>20CpG/100bp（人1，雞8，其他0），存在一些>10CpG/100bp的CpG密度較高區(qū)域（即CpG島）（約占基因組1%），但絕大多數(shù)密度<5CpG/100bp。在大鼠基因組中，48%的100bp基因組窗口沒有CpG，但當(dāng)使用1kb窗口時，基因組下降到5%。結(jié)果表明基因組主要為低CpG密度，在用于研究全基因組DNA甲基化的方法中需要考慮到這一點。
圖1：全基因組CpG密度。對應(yīng)于CpG/100 bp的全基因組1 kb區(qū)域數(shù)。
MeDIP-seq分析
此前研究已證明MeDIP分析偏好基因組低密度CpG區(qū)域。在NCBI GEO下載每個物種基因組發(fā)布的可用MeDIP-Seq數(shù)據(jù)集，以鑒定獲得數(shù)據(jù)的CpG密度分布。圖2為不同物種MeDIP-seq數(shù)據(jù)的代表性實例，分析重點在于兩個不同樣品組比較以鑒定用于數(shù)據(jù)分析的差異DNA甲基化區(qū)域（DMR）。MeDIP-seq數(shù)據(jù)集的DMR CpG密度分析結(jié)果表明大部分DMR為0–3 CpG/100bp的CpG密度，主要密度為1 CpG/100 bp，這與代表性基因組中的主要密度相關(guān)。在不同物種樣本之間觀察到一些變化，斑馬魚DMR尤其顯示出向稍高的1-4 CpG/100 bp的CpG密度轉(zhuǎn)變，可能歸因為精子和紅細(xì)胞兩種不同細(xì)胞類型�？傊Y(jié)果表明MeDIP-seq數(shù)據(jù)能有效分析低密度基因組CpG區(qū)域（<3 CpG/100 bp），其占不同物種的基因組90%以上。
（a）人類MeDIP研究1 DMR；（b）人類MeDIP研究2 DMR；（c）大鼠MeDIP研究1 DMR；（d）大鼠MeDIP研究1 DMR；（e）斑馬魚MeDIP研究1 DMR；（f）斑馬魚MeDIP研究1 DMR；（g）斑馬魚MeDIP研究2 DMR；（h）鋼頭鱒MeDIP研究1 DMR；（i）鋼頭鱒MeDIP研究1 DMR；（j）雞MeDIP研究1 DMR；（k）雞MeDIP研究2 DMR；（l）雞MeDIP研究2 DMR。
RRBS分析
在幾種不同物種中比較了用于DNA甲基化分析的RRBS方法，確定每個數(shù)據(jù)集的CpG/100bp密度（圖3）。數(shù)據(jù)集分析結(jié)果表明在DMR CpG密度分布中顯示出分裂：一些數(shù)據(jù)集顯示在＞10 CpG/100 bp 的RRBS DMR中，CpG密度向更高方向變化，而其他數(shù)據(jù)集則顯示向中等CpG密度變化。圖2（a-c）和圖3（c）中>10 CpG/100 bp的 CpG密度主要為10-12 CpG/100 bp，但如果增加到1 kb，則>10 CpG中約2/3低于10 CpG/1 kb。除魚類之外，只觀察到1或2 CpG/100 bp密度可忽略檢測。結(jié)果表明，與MeDIP分析相比，RRBS數(shù)據(jù)偏向更高密度的CpG區(qū)域（如≥3CpG/100bp）。有趣的是，鋼頭鱒魚的數(shù)據(jù)集在兩個不同實驗室的相同樣品上分別使用了MeDIP-Seq和RRBS方法（圖2和圖3），因此對相同樣品的不同分析進一步證明了MeDIP對較低密度CpG的偏倚和RRBS對較高密度CpG的偏倚。
（a） 人類RRBS研究1 DMR；（b）人類RRBS研究1 DMR；（c）大鼠RRBS研究1 DMR；（d）大鼠RRBS研究1 DMR；（e）斑馬魚RRBS研究1 DMR；（f）斑馬魚RRBS研究1 DMR；（g）斑馬魚RRBS研究2 DMR；（h）斑馬魚RRBS研究2 DMR；（i）鋼頭鱒魚RRBS研究1 DMR；（j）鋼頭鱒魚RRBS研究1 DMR。
WGBS分析
在幾個不同物種中比較了用于DNA甲基化的全基因組重亞硫酸鹽（WGBS）分析方法，確定每個分析的DMR CpG/100bp密度（圖4）。結(jié)果表明WGBS數(shù)據(jù)集的CpG密度與RRBS數(shù)據(jù)集CpG密度范圍類似。在向更高CpG密度（2-5 CpG/100bp）發(fā)生微小變化的分析與>10 CpG/100 bp的CpG密度分析之間存在差異。除了雞之外，1 CpG/100 bp DMR的檢測最少。觀察結(jié)果表明，WGBS數(shù)據(jù)靶向比MeDIP分析更高密度的CpG區(qū)域。
圖5：不同DNA甲基化分析方法的基因組百分比
（a） 每種方法的基因組百分比（1kb基因組窗口的百分比）與所有物種的平均值�？倵l形圖表示MeDIP 0–5 CpG/100bp、WGBS≥2 CpG/100bp、RRBS≥3 CpG/100bp、CpG島芯片陣列的基因組總百分比�？招臈l表示不同方法的reads比對限制百分比。
（b） MeDIP 0–5 CpG/100 bp、WGBS≥2 CpG/100 bp和RRBS≥3 CpG/100 bps的每種方法在不同物種的基因組百分比（插圖圖例）。
參考文獻：Beck D, Ben Maamar M, Skinner MK. Genome-wide CpG density and DNA methylation analysis method (MeDIP, RRBS, and WGBS) comparisons. Epigenetics. 2022 May;17(5):518-530.
全基因組DNA甲基化分析是用于基因組表征和差異DNA甲基化分析的最常見表觀遺傳學(xué)過程之一。先前的全基因組分析表明，CpG密度是DNA甲基化方法中的一個重要變量。目前的研究旨在分析各種不同物種基因組中的CpG密度，并將其與各種DNA甲基化分析數(shù)據(jù)集進行關(guān)聯(lián)分析。對人、大鼠、鳥類、魚類的基因組中觀察到類似的結(jié)果：90%以上的基因組區(qū)域?qū)儆诘兔芏阮悇e（1-3 CpG/100bp），小于10%的基因組區(qū)域?qū)儆诟呙芏阮悇e（>5 CpG/100bp）。甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）使用抗5-甲基胞嘧啶抗體免疫沉淀，然后進行下一代測序（MeDIP-Seq），MeDIP偏好<5 CpG/100bp的低CpG密度（對應(yīng)>95%的基因組）。減少代表性重亞硫酸鹽測序（RRBS）通常在≥3CpG/100bp的較高CpG密度區(qū)域中鑒定DMR（對應(yīng)約20%的基因組）。全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）在通常大于10 CpG/100bp更高的CpG密度區(qū)域分析，且WGBS可鑒定≥2 CpG/100bp區(qū)域（約占基因組50%）。CpG密度是DNA甲基化分析中的關(guān)鍵變量，不同分子技術(shù)專注于不同的基因組區(qū)域，本文比較了MeDIP-Seq、RRBS、WGBS三種DNA甲基化分析方法。
比較方法
MeDIP-seq、RRBS、WGBS每種技術(shù)均從目標(biāo)細(xì)胞類型或組織的DNA提取和純化開始。
MeDIP-seq將DNA超聲處理成幾百個堿基對的短片段，產(chǎn)生單鏈DNA以實現(xiàn)有效的抗體結(jié)合，然后使用5-甲基胞嘧啶抗體結(jié)合包含甲基化CpG位點的片段。這些片段通常用結(jié)合抗體的磁珠分離，并用PCR擴增DNA后測序。PCR包括通用引物和索引引物以及條形碼引物，以擴增所有DNA片段。MeDIP-seq的局限在于無法達到單堿基分辨率，不是高通量測序，不能鑒定單個CpG甲基化水平和高密度的CpG位點。
基于亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的RRBS和WGBS是可以達到單堿基分辨率的高通量DNA甲基化測序方法。
RRBS使用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化，在高GC密度CpG位點將未甲基化的DNA酶切成片段。對這些片段進一步處理并選擇大小并靶向啟動子和CpG島區(qū)域，所得片段進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，同時保留未轉(zhuǎn)化的甲基化胞嘧啶，隨后對片段進行PCR擴增并測序。
WGBS對全基因組進行亞硫酸鹽處理和分析，在亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化之前不進行甲基化片段分離。對亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的全基因組甲基化進行測序，并使用各種生物信息學(xué)方案，通常用于基因組表征。
比較結(jié)果
在人、大鼠、魚（斑馬魚和鋼頭鱒魚）和鳥類（雞）基因組中研究了全基因組CpG密度分布。從NCBI或Ensembl獲得參考基因組序列，初步分析1000bp窗口鑒定全基因組CpG密度�；蚪M主要由<3 CpG/100bp的CpG密度較低區(qū)域組成，小部分基因組位點的CpG密度較高。在所有不同物種的基因組中觀察到類似結(jié)果。在<3 CpG/100 bp的基因組區(qū)域中，對應(yīng)于97%的人基因組、98%的大鼠基因組、88%的斑馬魚基因組、93%的鋼頭鱒魚基因組、94%的雞基因組�；蚪M中很少有1kb區(qū)域>20CpG/100bp（人1，雞8，其他0），存在一些>10CpG/100bp的CpG密度較高區(qū)域（即CpG島）（約占基因組1%），但絕大多數(shù)密度<5CpG/100bp。在大鼠基因組中，48%的100bp基因組窗口沒有CpG，但當(dāng)使用1kb窗口時，基因組下降到5%。結(jié)果表明基因組主要為低CpG密度，在用于研究全基因組DNA甲基化的方法中需要考慮到這一點。
圖1：全基因組CpG密度。對應(yīng)于CpG/100 bp的全基因組1 kb區(qū)域數(shù)。
（a）人、（b）大鼠、（c）鋼頭鱒魚、（d）斑馬魚、（e）雞
MeDIP-seq分析
此前研究已證明MeDIP分析偏好基因組低密度CpG區(qū)域。在NCBI GEO下載每個物種基因組發(fā)布的可用MeDIP-Seq數(shù)據(jù)集，以鑒定獲得數(shù)據(jù)的CpG密度分布。圖2為不同物種MeDIP-seq數(shù)據(jù)的代表性實例，分析重點在于兩個不同樣品組比較以鑒定用于數(shù)據(jù)分析的差異DNA甲基化區(qū)域（DMR）。MeDIP-seq數(shù)據(jù)集的DMR CpG密度分析結(jié)果表明大部分DMR為0–3 CpG/100bp的CpG密度，主要密度為1 CpG/100 bp，這與代表性基因組中的主要密度相關(guān)。在不同物種樣本之間觀察到一些變化，斑馬魚DMR尤其顯示出向稍高的1-4 CpG/100 bp的CpG密度轉(zhuǎn)變，可能歸因為精子和紅細(xì)胞兩種不同細(xì)胞類型�？傊Y(jié)果表明MeDIP-seq數(shù)據(jù)能有效分析低密度基因組CpG區(qū)域（<3 CpG/100 bp），其占不同物種的基因組90%以上。
圖2：甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-Seq）
差異DNA甲基化區(qū)（DMRs）的百分比對應(yīng)于每100bp的CpG位點數(shù)量。（a）人類MeDIP研究1 DMR；（b）人類MeDIP研究2 DMR；（c）大鼠MeDIP研究1 DMR；（d）大鼠MeDIP研究1 DMR；（e）斑馬魚MeDIP研究1 DMR；（f）斑馬魚MeDIP研究1 DMR；（g）斑馬魚MeDIP研究2 DMR；（h）鋼頭鱒MeDIP研究1 DMR；（i）鋼頭鱒MeDIP研究1 DMR；（j）雞MeDIP研究1 DMR；（k）雞MeDIP研究2 DMR；（l）雞MeDIP研究2 DMR。
RRBS分析
在幾種不同物種中比較了用于DNA甲基化分析的RRBS方法，確定每個數(shù)據(jù)集的CpG/100bp密度（圖3）。數(shù)據(jù)集分析結(jié)果表明在DMR CpG密度分布中顯示出分裂：一些數(shù)據(jù)集顯示在＞10 CpG/100 bp 的RRBS DMR中，CpG密度向更高方向變化，而其他數(shù)據(jù)集則顯示向中等CpG密度變化。圖2（a-c）和圖3（c）中>10 CpG/100 bp的 CpG密度主要為10-12 CpG/100 bp，但如果增加到1 kb，則>10 CpG中約2/3低于10 CpG/1 kb。除魚類之外，只觀察到1或2 CpG/100 bp密度可忽略檢測。結(jié)果表明，與MeDIP分析相比，RRBS數(shù)據(jù)偏向更高密度的CpG區(qū)域（如≥3CpG/100bp）。有趣的是，鋼頭鱒魚的數(shù)據(jù)集在兩個不同實驗室的相同樣品上分別使用了MeDIP-Seq和RRBS方法（圖2和圖3），因此對相同樣品的不同分析進一步證明了MeDIP對較低密度CpG的偏倚和RRBS對較高密度CpG的偏倚。
圖3：不同物種的減少代表性亞硫酸鹽測序（RRBS）
差異DNA甲基化區(qū)域（DMR）的百分比對應(yīng)于每100bp的CpG位點數(shù)量（a） 人類RRBS研究1 DMR；（b）人類RRBS研究1 DMR；（c）大鼠RRBS研究1 DMR；（d）大鼠RRBS研究1 DMR；（e）斑馬魚RRBS研究1 DMR；（f）斑馬魚RRBS研究1 DMR；（g）斑馬魚RRBS研究2 DMR；（h）斑馬魚RRBS研究2 DMR；（i）鋼頭鱒魚RRBS研究1 DMR；（j）鋼頭鱒魚RRBS研究1 DMR。
WGBS分析
在幾個不同物種中比較了用于DNA甲基化的全基因組重亞硫酸鹽（WGBS）分析方法，確定每個分析的DMR CpG/100bp密度（圖4）。結(jié)果表明WGBS數(shù)據(jù)集的CpG密度與RRBS數(shù)據(jù)集CpG密度范圍類似。在向更高CpG密度（2-5 CpG/100bp）發(fā)生微小變化的分析與>10 CpG/100 bp的CpG密度分析之間存在差異。除了雞之外，1 CpG/100 bp DMR的檢測最少。觀察結(jié)果表明，WGBS數(shù)據(jù)靶向比MeDIP分析更高密度的CpG區(qū)域。
圖4：不同物種的全基因組重亞硫酸鹽（WGBS）分析
（a） 人類WGBS研究1 DMR；（b）大鼠WGBS研究1 DMR；（c）大鼠WGBS研究2 DMR；（d）斑馬魚WGBS研究1 DMR；（e）斑馬魚WGBS研究2 DMR；（f）雞WGBS研究1 DMR。圖5：不同DNA甲基化分析方法的基因組百分比
（b） MeDIP 0–5 CpG/100 bp、WGBS≥2 CpG/100 bp和RRBS≥3 CpG/100 bps的每種方法在不同物種的基因組百分比（插圖圖例）。
參考文獻：Beck D, Ben Maamar M, Skinner MK. Genome-wide CpG density and DNA methylation analysis method (MeDIP, RRBS, and WGBS) comparisons. Epigenetics. 2022 May;17(5):518-530.
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