大腸桿菌蛋白表達(dá)原理方法和種類

大腸桿菌蛋白表達(dá)原理
 
1. 表達(dá)載體
 
小型環(huán)狀DNA可以自我復(fù)制。完整的質(zhì)粒載體必須具有復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子，插入的目的基因，篩選標(biāo)記和終止子。根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的類型可分為單純表達(dá)載體和融合表達(dá)載體，前者是在目標(biāo)蛋白的N端/C端添加特殊的序列，從而促進(jìn)蛋白的可溶性和正確折疊，方便目的蛋白的快速親和純化，或者目標(biāo)蛋白的表達(dá)定位。His和GST-是常使用的融合標(biāo)簽。
 
2. 表達(dá)宿主菌
 
表達(dá)蛋白質(zhì)的生物即為大腸桿菌。宿主細(xì)菌的選擇主要基于宿主細(xì)菌的特征和靶蛋白的特征。例如，靶蛋白需要形成二硫鍵�？梢赃x擇Origami 2系列，Origami可以顯著增加在細(xì)胞質(zhì)中形成二硫鍵的可能性，并提高蛋白質(zhì)的溶解度和活性。
 
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)種類
 
1. T7大腸桿菌表達(dá)
 
T7大腸桿菌表達(dá)表達(dá)目的基因的水平較高。但是如果目的基因?qū)Υ竽c桿菌有毒性，則會(huì)影響細(xì)胞的生長。T7大腸桿菌表達(dá)是用T7啟動(dòng)子和T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系的元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。T7 RNA聚合酶是高活性RNA聚合酶，mRNA的合成速度是大腸桿菌中RNA聚合酶的五倍，并且某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的序列也可以被轉(zhuǎn)錄，因此T7RNA聚合酶和T7噬箘體啟動(dòng)子的存在的情況下，大腸桿菌本身的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)競爭不過T7噬箘體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7噬箘體啟動(dòng)子控制蛋白轉(zhuǎn)錄。
 
2. Lac和Tac大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
 
Lac和Tac大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一種基于大腸桿菌紫膠操縱子調(diào)控機(jī)制設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。紫膠操縱子具有多順反子結(jié)構(gòu)。在沒有誘導(dǎo)劑的情況下，負(fù)調(diào)控因子lacI基因產(chǎn)物與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，并開始組織轉(zhuǎn)錄。在誘導(dǎo)物IPTG的存在下，與阻遏物結(jié)合后，與操縱子結(jié)合的能力降低并解離，從而激活了lac操縱子的轉(zhuǎn)錄。用tac啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為Tac表達(dá)系統(tǒng)。為了能夠嚴(yán)格調(diào)節(jié)Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)，將能夠產(chǎn)生過量lacI阻遏蛋白的lacI基因的突變型lacIq應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng)。然而，當(dāng)使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍然觀察到更高水平的背景轉(zhuǎn)錄，并且將lacIq基因插入表達(dá)載體中以確保更多的lacI阻遏蛋白產(chǎn)生。
 
目前，許多商業(yè)表達(dá)載體是在Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上改進(jìn)和發(fā)展的。 Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)使用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，但是由于IPTG本身的毒性，從安全角度考慮，它不適合用于醫(yī)學(xué)目的表達(dá)和制備重組蛋白。一些國家還規(guī)范了供人類使用的重組蛋白的生產(chǎn)。 IPTG無法用于生產(chǎn)過程，因此認(rèn)為阻遏蛋白lacI的溫度敏感突變體lacI（ts）可以應(yīng)用于Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)。這些突變基因可以插入表達(dá)載體或整合到染色體中以實(shí)現(xiàn)lac。tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)格調(diào)節(jié)，在較低溫度（30°C）下受到抑制，而在較高溫度（42°C）下開放。乳糖也可以代替IPTG誘導(dǎo)劑使用，但是其效率受多種因素的影響，并且受限制，因此乳糖導(dǎo)的有效劑量比IPTG高得多，乳糖本身可以被大腸桿菌作為碳源代謝。乳糖的存在還可以引起細(xì)菌的生理和生長特性的變化。
 
3. PL和PR大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
 
以λ噬箘體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR為核心構(gòu)建的系統(tǒng)稱為PL和PR大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。啟動(dòng)子PL、PR具有很強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力，利用它們來構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展初期就已被提出來并加以研究。這種表達(dá)系統(tǒng)基于溫度敏感突變體cl857的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，該基因產(chǎn)物在較低溫度（30℃）時(shí)以活性形式存在，在較高溫度（42℃）時(shí)失活。這種表達(dá)載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定，這是因?yàn)榫�體中沒有cl基因產(chǎn)物，PL或PR啟動(dòng)子的高強(qiáng)度直接轉(zhuǎn)錄所導(dǎo)致。解決這個(gè)問題的辦法之一是用溶源化λ噬箘體的大腸桿菌作為PL和PR啟動(dòng)子表達(dá)載體的宿主菌；辦法之二是把cI857ts基因組裝在表達(dá)載體上，這樣就可以有更大的宿主菌選擇范圍。
 
由于PL和PR表達(dá)系統(tǒng)在誘導(dǎo)時(shí)不需要加入化學(xué)誘導(dǎo)劑，且成本低廉，因此起初幾個(gè)在大腸桿菌系統(tǒng)中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用這種表達(dá)系統(tǒng)。但是，它也有其本身的缺陷，首先是在熱刺激過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會(huì)被激活，其中包括蛋白水解酶，因此有可能降解表達(dá)的重組蛋白。其次是大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42℃比較緩慢，這種的升溫方式可能影響誘導(dǎo)效果，影響重組蛋白的表達(dá)量。
 
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