腦脊液的蛋白質(zhì)組分析揭示了帕金森病的候選生物標(biāo)志物

帕金森病（PD）是第二常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，在世界范圍內(nèi)日益增長(zhǎng)，影響著全世界數(shù)百萬(wàn)人，并且隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)病率顯著增加。但迄今為止，在臨床上還沒(méi)有可靠的生物標(biāo)志物。2022年6月Matthias Mann及Sebastian Virreira Winter等團(tuán)隊(duì)在Cell Reports Medicine上發(fā)表名為“Proteome profiling of cerebrospinal fluid reveals biomarker candidates for Parkinson’s disease”的文章，使用腦脊液蛋白質(zhì)組分析以發(fā)現(xiàn)帕金森病的候選生物標(biāo)志物。在文章中，研究者描述了一個(gè)可擴(kuò)展和靈敏的基于質(zhì)譜(MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，用于腦脊液蛋白質(zhì)組分析。研究者從腦脊液中重復(fù)量化了超過(guò)1700個(gè)蛋白質(zhì)。使用機(jī)器學(xué)習(xí)篩選出了PD患者中OMD、CD44、VGF、PRL和MAN2B1的改變以及與臨床評(píng)分顯著相關(guān)。研究者還發(fā)現(xiàn)在LRRK2、G2019S攜帶者中存在神經(jīng)炎癥的特征。最后與研究者之前獲得的尿液蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)了PD相關(guān)變化（包括溶酶體蛋白）有大量重疊，這為提高PD發(fā)病機(jī)制的理解開(kāi)辟了新途徑。

影響因子：16.988

組學(xué)技術(shù)：DIA蛋白質(zhì)

實(shí)驗(yàn)樣本：215個(gè)腦脊液樣本RESRUIT

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用于腦脊液蛋白質(zhì)組分析的PD隊(duì)列概述

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為了研究帕金森病如何影響患者的腦脊液并識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物，我們采用了“矩形”生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)策略。研究者分析了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列共215個(gè)個(gè)體的腦脊液樣本，包括113名健康對(duì)照（HC）和102名PD患者（第一個(gè)隊(duì)列稱HBS隊(duì)列、第二個(gè)隊(duì)列稱LCC隊(duì)列）。 

 

腦脊液樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)特征

研究者開(kāi)發(fā)了一個(gè)穩(wěn)健、自動(dòng)化和高通量的基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，使用數(shù)據(jù)獨(dú)立采集（DIA）策略進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析（圖 1A）。該策略先前已取得了前所未有的深度，并揭示了多個(gè)獨(dú)立的阿爾茨海默病隊(duì)列中具有生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)組變化。研究者應(yīng)用他們自己的工作流程，探究無(wú)論患者是否存在LRRK2中與疾病相關(guān)的G2019S突變。為了最大限度提高蛋白質(zhì)檢測(cè)的深度和覆蓋率，研究者通過(guò)合并三個(gè)庫(kù)生成了特定于隊(duì)列的混合光譜庫(kù)（圖1B）。在超過(guò)70%的樣本中分別量化了1290個(gè)（HBS）和1440個(gè)（LCC）蛋白質(zhì)組（圖1C、D）。量化的蛋白質(zhì)強(qiáng)度跨越了四個(gè)數(shù)量級(jí)（圖1E、1F）。僅前10個(gè)最豐富的蛋白質(zhì)就貢獻(xiàn)了約38%的總CSF蛋白質(zhì)組信號(hào)，說(shuō)明了分析的挑戰(zhàn)（圖1E和1F）。

 

根據(jù)人類蛋白圖譜（HPA）注釋，研究者進(jìn)一步將已鑒定的蛋白分類為細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜分泌的蛋白質(zhì)（許多蛋白質(zhì)被多次分配）�？偟膩�(lái)說(shuō)，94%的已鑒定蛋白至少攜帶一個(gè)注釋，其中36%為分泌蛋白，70%為細(xì)胞內(nèi)蛋白，36%為跨膜蛋白。此外，大多數(shù)定量蛋白被注釋為在大腦和肝臟中富集，這與腦脊液是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外液的事實(shí)相一致。綜上所述，通過(guò)使用較小的腦脊液體積，我們單次分析獲得了非常高的腦脊液蛋白質(zhì)組覆蓋率，從而為發(fā)現(xiàn)PD中的生物標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。

 

圖 1

定量精度和樣品質(zhì)量的評(píng)估

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研究者為了評(píng)估數(shù)據(jù)的定量精度，通過(guò)重復(fù)測(cè)量合并的腦脊液樣本，研究自動(dòng)化工作流程的內(nèi)部和分析間的變異性。分析顯示，13%的內(nèi)部板塊變異系數(shù)和19%的板塊間變異系數(shù)（CV）的高技術(shù)重現(xiàn)性。大約1100人的檢測(cè)間和檢測(cè)內(nèi)CV低于20%，1500人低于50%（圖1G）。受試者之間的個(gè)體間生物變異性要大得多，所有蛋白質(zhì)中只有10%的CV低于20%（圖1G）。這表明檢測(cè)方法的技術(shù)變異性比生物學(xué)變異性小得多，這是成功發(fā)現(xiàn)CSF中PD特異性蛋白質(zhì)組特征和潛在生物標(biāo)記物的重要前提條件。

 

不一致的樣本收集和處理可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性偏差并阻礙真正的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。為了確保腦脊液蛋白的定量變化是由于疾病相關(guān)的病理改變，研究者根據(jù)先前建立的凝固相關(guān)蛋白、血小板和紅細(xì)胞的質(zhì)量標(biāo)記模型來(lái)評(píng)估所有樣本的質(zhì)量，以確定在分析前處理中是否存在潛在問(wèn)題的樣本（圖2A、2B）。

 

結(jié)果表明：紅細(xì)胞特異性標(biāo)記的污染程度在樣本間有很高的變異性，可能是由于與血液穿刺相關(guān)的污染（圖2A、2B）。研究者從HBS隊(duì)列中標(biāo)記了14個(gè)樣本（8個(gè)PD, 6個(gè)HC），從LCC隊(duì)列中標(biāo)記了17個(gè)樣本（4個(gè)PD, 13個(gè)HC）的紅細(xì)胞污染，并將其從進(jìn)一步分析中刪除（圖2C和2D）。共有182個(gè)受試者的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并被用于統(tǒng)計(jì)分析。研究者發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和腦脊液中紅細(xì)胞特異性蛋白的數(shù)量之間沒(méi)有相關(guān)性（圖2E）。

 

研究者還進(jìn)一步排除了來(lái)自 HBS隊(duì)列的單個(gè)樣本，該樣本在主成分分析（PCA）中遠(yuǎn)離其他樣本聚集，而LCC隊(duì)列中的單個(gè)樣本在蛋白質(zhì)組深度上是異常值。我們隨后通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)自 HBS隊(duì)列的 79 個(gè)樣本和來(lái)自 LCC 隊(duì)列的 103 個(gè)樣本，以確定疾病表現(xiàn)和 LRRK2 突變狀態(tài)對(duì) CSF 蛋白質(zhì)組的影響。

 

圖 2

PD患者腦脊液和基于機(jī)械學(xué)習(xí)的對(duì)照組分類中PD相關(guān)蛋白質(zhì)組改變

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為了研究PD患者與對(duì)照組相比腦脊液蛋白質(zhì)組的改變，研究者進(jìn)行了ANCOVA分析，將年齡、性別和 LRRK2 突變狀態(tài)視為混雜因素。在5%的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）下，與HBS對(duì)照組相比，在HBS隊(duì)列PD患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)了三種顯著調(diào)控蛋白（CPM、OMD和RFNG）；與LCC對(duì)照組相比，在LCC隊(duì)列PD患者中發(fā)現(xiàn)了一種（PRCP）（圖3A）。

 

PD患者的骨調(diào)節(jié)蛋白（OMD）和細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白（CD44）蛋白水平均顯著升高（圖3B-3E）。隨后研究者進(jìn)行了GO富集分析。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，PD樣品中升高的蛋白質(zhì)在溶酶體相關(guān)功能上富集（圖3F）。

 

由于在兩組人群中都存在（但數(shù)量很少）共同改變的蛋白質(zhì)，研究者使用最近引入的開(kāi)源工具OmicLearn測(cè)試了機(jī)器學(xué)習(xí)（ML）如何區(qū)分PD患者和對(duì)照組。在每次訓(xùn)練迭代中選擇35個(gè)最具識(shí)別力的用于訓(xùn)練模型的蛋白質(zhì)，分類器根據(jù)它們的特征重要性對(duì)它們進(jìn)行排序（圖3G）。其中催乳素是50次訓(xùn)練迭代中最重要的特征。當(dāng)使用這些特征來(lái)訓(xùn)練XGBoost時(shí)并基于集成樹(shù)的模型和交叉驗(yàn)證方案，ROC曲線的平均曲線下面積（AUC）為0.72±0.08。

 

AUC是分類模型性能的常用度量，范圍包括0（所有預(yù)測(cè)都是錯(cuò)誤的）到1（所有預(yù)測(cè)都是正確的）。敏感性（即正確分類PD患者的比率）和特異性（即正確分類PD陰性個(gè)體的比率）分別為67%和66%（圖3H）。綜上所述，研究者的CSF蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與ML算法相結(jié)合，可以對(duì)疾病狀態(tài)進(jìn)行分類。更重要的是確定了幾種有前景的PD相關(guān)蛋白，為未來(lái)的研究開(kāi)辟了新的線索。

 

圖 3

致病性LRRK2 G2019S突變對(duì)腦脊液蛋白組的影響

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由于LCC隊(duì)列中有大量攜帶LRRK2 G2019S突變的受試者，研究者探索了LRRK2突變狀態(tài)是否會(huì)改變腦脊液蛋白質(zhì)組。我們?cè)俅尾捎眯詣e、樣本收集年齡、研究中心和PD狀態(tài)作為混雜因素。在FDR為5%時(shí)，突變顯著改變了HLADRA、HLA-DRB1、HLA-DPA1、CTSS、PLD4、TKT、ITGB2、PRDX3、ITIH5、CNDP1和FAH蛋白的豐度（圖4A）。根據(jù)樣品中鑒定的肽段，我們可以區(qū)分兩種HLA-DRB1蛋白，這兩種蛋白都在LRRK2 G0219S載體中顯著富集。此外，F(xiàn)DR為5%的T檢驗(yàn)直觀地證實(shí)了突變攜帶者中HLA-DRA、HLA-DRB1和HLA-DPA1的上調(diào)（圖4a和4B）。這些 HLA 蛋白以及 PLD4 和 CTSS 在在 PD 患者中顯著升高（>1.7倍；圖 4B-4D）。在整體范圍內(nèi)使用這種方法觀察到與野生型(WT)等位基因攜帶者相比，LRRK2 G2019S攜帶者的CSF蛋白質(zhì)組中升高的蛋白質(zhì)富含與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的類別，進(jìn)一步支持了炎癥反應(yīng)增強(qiáng)與PD之間密切關(guān)聯(lián)的實(shí)質(zhì)性證據(jù)(圖4E)。

 

此外，對(duì)健康個(gè)體的非表現(xiàn)性LRRK2攜帶者（NMCs）的分析也顯示出在致病性LRRK2攜帶者中，一些HLA分子CTSS以及ADAM10和FAM234A（ITFG3）表達(dá)上調(diào)，其中HLA-DRB1是唯一在FDR為5%時(shí)鑒定到顯著性水平的蛋白。與健康個(gè)體相比，致病性LRRK2攜帶者發(fā)生PD的可能性更高；因此，該分析中鑒定的蛋白質(zhì)可能包括預(yù)后因素。研究者最近在兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，多個(gè)組織蛋白酶家族包括組織蛋白酶A、B、C、D、H、L、O、S和Z的水平在LRRK2 G2019S攜帶者的尿液中顯著增加。研究者也在腦脊液中檢測(cè)到這些組織蛋白酶，但與尿液相比，只有組織蛋白酶S（CTSS）受突變狀態(tài)的顯著影響（圖4F）。

 

圖 4

腦脊液和尿液蛋白質(zhì)組的整合

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研究者在其之前的研究中分析了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立的橫向隊(duì)列（Columbia和LCC）的235個(gè)尿液樣本，包括兩種類型的對(duì)照組、健康人群、LRRK2 G2019S攜帶者、LRRK2 G2019S突變和無(wú)LRRK2 G2019S突變的PD患者，共量化了2365個(gè)尿蛋白。隨后研究者整合了尿液和腦脊液蛋白質(zhì)組來(lái)確定共同調(diào)節(jié)的蛋白。

 

結(jié)果顯示：超過(guò)1000個(gè)重疊蛋白質(zhì)，相當(dāng)于兩種生物流體中所有已識(shí)別蛋白質(zhì)的36%（圖5A）。匹配共同的蛋白質(zhì)豐度揭示了兩種生物液體之間的明確相關(guān)性（圖5 B）。兩種液體中最豐富的蛋白包括ALB，PTGDS，ORM1，SERPINA1，B2M，以及幾種載脂蛋白和免疫球蛋白（圖5B）。

 

此外，F(xiàn)ischer對(duì)與尿液或腦脊液中特異性發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或其共同重疊相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)的精確測(cè)試與兩種體液中鑒定的所有蛋白質(zhì)相比顯著豐富（圖5C）。 

 

與對(duì)照組相比，將PD患者CSF（HBS和LCC）和尿液（Columbia）中量化的所有常見(jiàn)蛋白質(zhì)的ANCOVA q值與對(duì)照相關(guān)，表明兩種液體中的幾種蛋白質(zhì)受到調(diào)節(jié)（圖5D-E）。

 

其中包括骨調(diào)節(jié)蛋白（OMD），其水平在PD患者的尿液中也顯著升高，平均倍數(shù)變化為1.47（圖5F）。接下來(lái)，研究者將LCC隊(duì)列的CSF樣本和Columbia或LCC隊(duì)列的尿液樣本中定量的所有常見(jiàn)蛋白的LRRK2 G2019S與LRRK2 WT進(jìn)行整合（圖5G和5H）。結(jié)果顯示，在兩種基質(zhì)中以LRRK2狀態(tài)依賴性方式調(diào)節(jié)組織蛋白酶S（圖5G-H）。

 

與LRRK2 WT攜帶者相比，LRRK2 G2019S攜帶者CSF中的組織蛋白酶S水平更高，Columbia和LCC隊(duì)列的平均倍數(shù)變化分別為1.31（p值為0.0619）和1.65（p值為0.0001574）（圖5I）。

 

圖 5

腦脊液蛋白質(zhì)組與指示疾病嚴(yán)重程度的臨床評(píng)分的相關(guān)性

接下來(lái)，研究者研究了HBS隊(duì)列中的蛋白質(zhì)水平變化是否與統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表（UPDRS）評(píng)估的PD病理學(xué)嚴(yán)重程度相關(guān)（圖6）。研究者發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性PD患者中，有27個(gè)蛋白與UPDRS評(píng)分顯著相關(guān)（p < 0.001；圖6A）。

 

PD患者中最高正相關(guān)的蛋白包括CHST6（=1.6E-5和皮爾遜相關(guān)性= 0.72）、MIF（=1.8E-5和= 0.67）、LYVE1（=4.8E-5和= 0.64）、EFNA1（=5E-5和= 0.64）和ADM（=1.3E-4和= 0.61；圖6A）。PD患者中最負(fù)相關(guān)的蛋白包括POMGNT1（p = 4.6E-5和=0.64）、TMEM132A（p = 5.7E-5和=0.63）、ADAM22（p = 8.8E-5和=0.62）、PAM（p = 1.9E-4和r=0.6）和ST6GAL2（p = 2.7E-5和=0.59；Figure 6A）。有趣的是，與對(duì)照組相比，這些蛋白質(zhì)在PD病例中沒(méi)有顯著改變。然而，ADM是與簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查（MMSE）評(píng)分（p=9.3E-5；r=-0.43；認(rèn)知障礙的定量測(cè)量）負(fù)相關(guān)最強(qiáng)的蛋白。值得注意的是，在樣本采集時(shí)沒(méi)有人出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆或認(rèn)知障礙（PD平均得分28.3，對(duì)照組平均得分28.4）。

 

此外，研究者還將腦脊液蛋白的相關(guān)性評(píng)分與之前在尿液中獲得的研究結(jié)果進(jìn)行了比較。UPDRS III評(píng)分（尿液唯一可用評(píng)分）的皮爾遜系數(shù)比較顯示:10種蛋白質(zhì)（APOF、MAN2B2、LYVE1、APLP1、ALDOA、IGF2、SUSD5、CD99、S100A7和VGF）的系數(shù)均高于0.4或低于0.4（圖6B）。其中，VGF與兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的UPDRS III評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（尿液和腦脊液中的分別為p=2.8E-3和7.6E-3；圖6C）�？傊�，該分析表明通過(guò)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估的PD患者的疾病進(jìn)展會(huì)影響CSF和尿液中的一組類似蛋白質(zhì)。

 

在LCC隊(duì)列中，可以獲得所有受試者的蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估（MoCA）分?jǐn)?shù)。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)CHIT1與所有患者的MoCA評(píng)分顯負(fù)相關(guān)（在所有受試者中p=1.6E-5和r=0.48；圖S5D），而這種相關(guān)性在PD患者中更顯著（在PD患者中p=1.9E-9和r=0.81；圖S5E）。在腦脊液中，與MoCA評(píng)分呈強(qiáng)正相關(guān)的兩個(gè)蛋白，RELN和PENK，與年齡呈負(fù)相關(guān)。因此，腦脊液蛋白質(zhì)組中的多種蛋白質(zhì)與疾病的嚴(yán)重程度和疾病的不同臨床重要方面密切相關(guān)。

 

   文章小結(jié)   

研究者應(yīng)用了一個(gè)高度可復(fù)制、可擴(kuò)展的基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程來(lái)對(duì)PD患者的腦脊液進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。相比于對(duì)照組，在PD患者中可以顯著觀察到蛋白質(zhì)組的變化，并確定了LRRK2、G2019S攜帶者特異性的生物標(biāo)志物。當(dāng)然研究者還需要分析更大的患者隊(duì)列進(jìn)行進(jìn)一步的研究，去發(fā)現(xiàn)更多潛在的生物標(biāo)志物。接下來(lái)研究者需要開(kāi)發(fā)臨床和靶向分析來(lái)驗(yàn)證生物標(biāo)志物，然后在臨床常規(guī)中使用一種測(cè)試，以實(shí)現(xiàn)早期疾病檢測(cè)和患者分層。