2023年植物表觀轉(zhuǎn)錄組m6A與m5C研究的最新進展
被稱為表觀轉(zhuǎn)錄組（epitranscriptome）的RNA修飾正成為基因調(diào)控的廣泛調(diào)控機制。由于繪制轉(zhuǎn)錄組范圍RNA修飾測序策略的改進，以及分別對沉積、去除和識別RNA修飾的writers、erasers和readers密集表征，表觀轉(zhuǎn)錄組學領(lǐng)域最近取得了較大進展。本文綜述了近年來植物表觀轉(zhuǎn)錄組及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控和不同生理過程中調(diào)控機制的研究進展，主要重點介紹了N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）。
在植物表觀轉(zhuǎn)錄組中，m6A是mRNA上最普遍和最經(jīng)典的內(nèi)部修飾，其他包括m5C、m1A和ψ圖譜，也已經(jīng)在一些植物的轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)進行了分析，并鑒定出其writers。此外，植物mRNA在其5′端也被修飾，如經(jīng)典的m7G或非經(jīng)典的NAD caps（圖1a）。
圖1：植物表觀轉(zhuǎn)錄組概述和表觀轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)。
表觀轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的進展
（1）基于抗體、化學和酶的表觀轉(zhuǎn)錄組分析
將下一代測序與修飾RNA的抗體免疫沉淀相結(jié)合，包括m6A-seq、m1A-seq、m5C-seq、hm5C-seq、Ac4C-seq和m7G-seq（圖1b），是迄今為止最常用的繪制各種RNA修飾圖譜的方法。m6A-seq揭示了真核生物中數(shù)千個具有獨特且保守分布的轉(zhuǎn)錄本中m6A甲基化的普遍性，這些轉(zhuǎn)錄本優(yōu)先分布在終止密碼子周圍和3′非翻譯區(qū)（UTR）。然而，這些方法在表觀轉(zhuǎn)錄組標記位點信息上的分辨率欠佳（100–200nt）�？梢砸腩~外步驟來改進用于以單堿基分辨率檢測RNA修飾的方法。首先，將UV交聯(lián)步驟結(jié)合到RNA免疫沉淀中，如m6A單核苷酸分辨率交聯(lián)和免疫沉淀（miCLIP）、m6A交聯(lián)免疫沉淀（m6A-CLIP）和光交聯(lián)輔助m6A測序（PA-m6A-seq），但如果不利用甲基化加標對照或input文庫進行矯正或標準化，這些方法無法量化樣品之間的差異修飾。其次，應用特異性逆轉(zhuǎn)錄酶來提高RNA修飾的檢測分辨率，這些修飾在逆轉(zhuǎn)錄過程中會誘導錯誤摻入，這些方法包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶TGIRT的m1A圖譜，用于m1A甲基化的高分辨率分析。此外，已經(jīng)開發(fā)出使用與不同樣本的RNA連接的條形碼適配器的m6A-seq2，用于同時檢測不同樣本的m6A動態(tài)，該方法可以擴展到使用其特異性抗體來檢測其他RNA修飾。
盡管基于抗體的方法具有多功能性，但其應用必須依賴于高質(zhì)量的抗體和大量的起始RNA�；诨瘜W誘導標記的亞硫酸鹽測序（BS-seq）以檢測m5C RNA修飾（圖1b）已被開發(fā)用于表觀轉(zhuǎn)錄組標記檢測。亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），從而產(chǎn)生一種可以以單核苷酸分辨率下繪制m5C的標記。在植物中，BS-seq已用于檢測tRNA、rRNA和mRNA中的m5C。
酶技術(shù)的最新發(fā)展為以抗體非依賴性方式定量繪制m6A的精確位點提供了另一種有用的替代方案。這些技術(shù)要么利用m6A敏感的RNA限制性內(nèi)切酶，如MAZTER-seq和m6A-REF-seq，要么利用m6A-erasers/readers，如m6A-SEAL和DART-seq，或利用二甲基轉(zhuǎn)移酶如MjDim1將m6A轉(zhuǎn)化為m62A的m6A選擇性烯丙基化學標記和測序（m6A-SAC-seq）。
（2）Nanopore直接RNA測序檢測表觀轉(zhuǎn)錄組標記位點
盡管上述基于下一代測序方法的表觀轉(zhuǎn)錄組分析方法為RNA修飾分布和調(diào)控提供了前所未有的見解，但在多個樣品中定量繪制RNA修飾圖譜仍然存在挑戰(zhàn)。此外這些方法在很大程度上依賴于基于短讀長cDNA的測序，其需要將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。相比之下，Nanopore（納米孔）長讀長直接RNA測序（DRS）平臺正在成為一種有前途的方法，用于定量繪制和比較不同條件下單核苷酸分辨率的RNA修飾（圖1b）。在植物中，通過nanopore DRS為兩個m6A-writers缺失的擬南芥突變體生成了高分辨率的差異和比較m6A甲基化組。此外，nanopore DRS和Tombo已被用于鑒定擬南芥中的m5C peaks，其總體模式與m5C-seq鑒定相似。
此外還開發(fā)了RAM-NPPS、BERMP和PEA等方法來檢測植物中的m6A水平。其中PEA檢測擬南芥中m6A的敏感性和特異性超過70%。所有檢測方法都有其優(yōu)點和缺點，如不同的m6A分析技術(shù)需要從100 ng到20μg的不同RNA起始量，具有不同的檢測分辨率和推斷化學計量信息的能力（圖1c）。在設(shè)計表觀轉(zhuǎn)錄組分析研究時，應將這些特征與要解決的生物學問題結(jié)合起來考慮。
表征植物表觀轉(zhuǎn)錄組參與者的研究進展
表1：擬南芥中m6A和m5C效應基因的功能域，亞細胞定位和功能
在“功能域”列中，藍色表示低復雜度區(qū)域。PLACC，病毒樣氨基酸組成（Prion-like Amino Acid Composition）；CC，卷曲螺旋域（coiled-coil domain）；ZnF，鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger domain）；RRM；RNA識別motif（RNA recognition motif）。
植物m6A動態(tài)變化與調(diào)控研究進展
（1）不同植物的m6A特征
在包括梨、蘋果、草莓、大豆、甘藍型油菜、擬南芥、番茄、水稻、玉米等在內(nèi)多種植物中，已經(jīng)用m6A-seq或Nanopore DRS在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)對m6A靶標和分布進行廣泛的分析。m6A甲基化比率從普通小麥中的29%到13種植物中的51%不等。在從綠藻到高等陸生植物的大多數(shù)植物中，m6A在終止密碼子和3′UTR周圍中的分布偏好高度保守（圖3a），表明m6A是一種進化上保守的RNA修飾。盡管其豐度較低，但在梨、草莓、沙棘、甘藍型油菜和水稻等幾種植物中均檢測到CDS區(qū)域中的m6A標記。在極少數(shù)情況下，m6A在蘋果葉中的CDS區(qū)域富集最高。這些結(jié)果表明，CDS中的m6A可能是具有功能意義的重要特征。例如，在草莓果實成熟過程中，CDS中的m6A peaks值增加，意味著CDS中的m6A可能與不斷變化的發(fā)育環(huán)境有關(guān)。此外，在擬南芥、梨和沙棘的起始密碼子周圍，以及蘋果、甘藍型油菜和甜高粱的5’UTR內(nèi)也可以檢測到m6A富集。
在不同植物中，m6A主要分為兩個序列motif，包括保守的RRACH motif和植物特異性的URUAY（Y=C/U）motif，獨特的AAACCV（V=A/G/C）motif僅在甘藍型油菜（pak choi）中有報道（圖3a）。另外，m6A可能出現(xiàn)在同一植物的不同發(fā)育階段的不同序列環(huán)境中。例如在普通小麥中，GAGGGAG和UGUAY motif分別出現(xiàn)在谷物和葉片的m6A peaks中。
（2）m6A分布的動態(tài)調(diào)節(jié)
m6A甲基化在不同的發(fā)育階段動態(tài)變化，并對不同植物的環(huán)境刺激做出響應（圖3b）。在包括根、蓮座葉和花在內(nèi)的不同擬南芥組織中，顯示差異m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本比例顯著大于顯示不同轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄本，表明m6A可能有助于器官分化。
m6A修飾也受到各種環(huán)境脅迫的動態(tài)影響。非生物脅迫（如鹽脅迫、干旱脅迫和高溫脅迫）或生物脅迫（如病毒和真菌疾�。�，不會顯著影響3'UTR和終止密碼子周圍的整體m6A分布模式，但會極大地誘導選定轉(zhuǎn)錄本上的動態(tài)m6A重新分布。鹽脅迫顯著增加擬南芥幼苗和水稻枝條中的m6A甲基化水平，但不增加水稻根中的m6A甲基化水平；鹽脅迫誘導m6A動態(tài)沉積到鹽脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中，以保護它們在擬南芥中不被降解，并且還增加一些耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的m6A甲基化，以增強它們在甜高粱中的RNA穩(wěn)定性。干旱脅迫會導致干旱響應基因的m6A水平發(fā)生變化，從而影響它們在蘋果中的表達水平。鎘（Cd）脅迫在大麥根中誘導轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A高甲基化并改變水稻中大量轉(zhuǎn)錄本的甲基化水平�？傊�，這些觀察結(jié)果表明應激誘導的m6A重新分布在應激響應中的重要作用。
盡管許多研究已經(jīng)揭示了植物m6A甲基化的動態(tài)變化在植物不同組織器官、不同年齡和不同應激依賴性方式中的重要作用，但迄今為止其潛在機制仍然難以捉摸。這種動態(tài)的m6A調(diào)節(jié)在各種情況下可以部分地通過滴定（titration）m6A writers和erasers水平來實現(xiàn)，從而導致整體的m6A水平重新分布。在擬南芥中，鹽脅迫可以通過上調(diào)m6A writer基因MTA、MTB、VIR和FIP37的表達而增加m6A甲基化（圖3c）。ALKBH10B表達也在鹽脅迫中上調(diào)，表明鹽脅迫誘導的m6A動態(tài)變化由m6A writers和erasers水平增加共同作用。干旱脅迫降低了沙棘中的m6A甲基化，這與m6A去甲基化酶基因HrALKBH10B/10C/10D的表達顯著增加有關(guān)。除轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，在各種條件下m6A效應基因的轉(zhuǎn)錄后修飾或m6A recruiters招募也可能促進m6A動態(tài)變化。例如在藍光處理后，MTA、MTB和FIP37被招募到CRY2核體中，用于中心振蕩器轉(zhuǎn)錄本上的選擇性m6A甲基化。進一步探索在各種條件下選擇性轉(zhuǎn)錄本上m6A動態(tài)變化的潛在機制將有助于對m6A依賴性動態(tài)調(diào)控的機制理解。
植物表觀轉(zhuǎn)錄組在基因調(diào)控中的研究進展
RNA修飾通過影響mRNA代謝的各個方面來決定植物mRNA命運，包括可變剪接（alternative splicing，AS）、可變聚腺苷酸化（alterative polyadenylation，APA）、折疊（folding）、翻譯、定位、轉(zhuǎn)運和衰變（圖2a和圖4）。這些對mRNA代謝的影響最終影響植物發(fā)育和應激響應中的一系列生理過程，正如對RNA修飾效應基因中缺陷的突變體集合所表征的。
a. OsEDM2L介導OsEAT1的m6A修飾，導致水稻花藥發(fā)育中OsEAT1的可變剪接。
b. m6A修飾影響擬南芥中的可變聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）。CPSF30L與m6A修飾的SOC1 mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)其APA并生成相對穩(wěn)定的SOC1轉(zhuǎn)錄本，從而導致較短的3'UTR以促進開花。CPSF30L還通過調(diào)節(jié)硝酸鹽信號通路中幾種m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本（包括NRT1.1和WRKY1）的APA來介導硝酸鹽信號。VIR介導鹽脅迫響應中幾種應激相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾和APA。
c. mRNA腺苷甲基化酶（MTA，METTL3的直系同源物）在鹽脅迫應答轉(zhuǎn)錄本上的m6A沉積與RNA二級結(jié)構(gòu)減少相關(guān)，導致RNA穩(wěn)定性增加。
d. m6A修飾影響幾種作物中的蛋白質(zhì)翻譯。在草莓果實成熟中，F(xiàn)veMTA和FveMTB介導的ABAR m6A修飾促進其翻譯。在蘋果中，MhYTP2與m6A修飾的MdGDH1L結(jié)合促進其翻譯以賦予白粉病抗性。在水稻中，OsNSUN2依賴性m5C修飾增加蛋白質(zhì)合成以增強水稻對熱應激的響應。
e. 在擬南芥中，m5C RNA修飾通過嫁接連接調(diào)控RNA轉(zhuǎn)運。
f. m6A修飾影響各種植物中的RNA穩(wěn)定性。在擬南芥中，F(xiàn)IP37和MTA介導的WUS和STM的m6A修飾降低了它們的mRNA穩(wěn)定性以維持正常的干細胞活性。m6A erasers ALKBH10B使FT、SPL3和SPL9去甲基化，從而增強其mRNA穩(wěn)定性以促進擬南芥開花。在水稻中，OsFIP37與OsFAP1相互作用以在OsYUCCA3轉(zhuǎn)錄本上沉積m6A修飾以促進雄性減數(shù)分裂所需的生長素生物合成。在番茄果實中，SlALKBH2去甲基化并增強SlDML2穩(wěn)定性以加速果實成熟。在草莓中，F(xiàn)veMTA和FveMTB在NCED5和AREB1轉(zhuǎn)錄本上沉積m6A修飾，從而增強其RNA穩(wěn)定性以促進果實成熟。在蘋果中，MhYTP2與MdMLO19和MdMLO19-X1的m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合，使其轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定以促進對白粉病的抗性。
g. TRM4B依賴性m5C修飾增強了其靶轉(zhuǎn)錄本在擬南芥根發(fā)育中的RNA穩(wěn)定性。
展望
在過去的十年中，植物表觀轉(zhuǎn)錄組在不同植物脅迫下的m6A動態(tài)以及對模式植物擬南芥和水稻中m6A和m5C修飾的機理理解方面取得了快速進展。目前的證據(jù)有力表明，表觀轉(zhuǎn)錄組學標記是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的重要層面，其決定mRNA命運并最終影響植物發(fā)育和對各種環(huán)境脅迫的響應。然而，我們對植物表觀轉(zhuǎn)錄組的理解仍處于起步階段。關(guān)于表觀轉(zhuǎn)錄組標記靶標選擇性和功能模式的許多未解決問題仍有待探索。例如，writers和erasers如何在不同的生理環(huán)境中選擇他們其標靶？mRNA修飾如何響應環(huán)境刺激而動態(tài)調(diào)節(jié)？reader蛋白如何識別其靶標并在隨后的RNA代謝過程中發(fā)揮作用？此外，由于RNA修飾高度依賴于細胞環(huán)境，在不同的組織和器官、不同的發(fā)育階段或不同的應激下，相關(guān)的調(diào)節(jié)通路可能不同。因此，有必要通過新開發(fā)的分析技術(shù)以單核苷酸分辨率分析從組織水平到細胞水平的RNA修飾動態(tài)變化，這將推進和擴展我們在植物表觀轉(zhuǎn)錄組知識的理解。
在植物表觀轉(zhuǎn)錄組中，m6A是mRNA上最普遍和最經(jīng)典的內(nèi)部修飾，其他包括m5C、m1A和ψ圖譜，也已經(jīng)在一些植物的轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)進行了分析，并鑒定出其writers。此外，植物mRNA在其5′端也被修飾，如經(jīng)典的m7G或非經(jīng)典的NAD caps（圖1a）。
圖1：植物表觀轉(zhuǎn)錄組概述和表觀轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)。
- 植物中已知的RNA修飾。轉(zhuǎn)錄本中不同RNA修飾的主要位點。在植物中，mRNA被N7甲基鳥苷（m7G）或煙酰胺腺嘌呤二磷酸（NAD）封端并含有內(nèi)部修飾，包括N6-甲基腺苷（m6A）、N1甲基腺苷（m1A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿苷（ψ）。
- RNA修飾圖譜分析方法。將下一代測序與基于抗體、化學和酶的方法相結(jié)合的技術(shù)（上），Nanopore直接RNA測序（下）。
- 不同m6A分析技術(shù)的關(guān)鍵特征比較。星號表示文庫構(gòu)建和測序前樣品制備所需時間。
表觀轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的進展
（1）基于抗體、化學和酶的表觀轉(zhuǎn)錄組分析
將下一代測序與修飾RNA的抗體免疫沉淀相結(jié)合，包括m6A-seq、m1A-seq、m5C-seq、hm5C-seq、Ac4C-seq和m7G-seq（圖1b），是迄今為止最常用的繪制各種RNA修飾圖譜的方法。m6A-seq揭示了真核生物中數(shù)千個具有獨特且保守分布的轉(zhuǎn)錄本中m6A甲基化的普遍性，這些轉(zhuǎn)錄本優(yōu)先分布在終止密碼子周圍和3′非翻譯區(qū)（UTR）。然而，這些方法在表觀轉(zhuǎn)錄組標記位點信息上的分辨率欠佳（100–200nt）�？梢砸腩~外步驟來改進用于以單堿基分辨率檢測RNA修飾的方法。首先，將UV交聯(lián)步驟結(jié)合到RNA免疫沉淀中，如m6A單核苷酸分辨率交聯(lián)和免疫沉淀（miCLIP）、m6A交聯(lián)免疫沉淀（m6A-CLIP）和光交聯(lián)輔助m6A測序（PA-m6A-seq），但如果不利用甲基化加標對照或input文庫進行矯正或標準化，這些方法無法量化樣品之間的差異修飾。其次，應用特異性逆轉(zhuǎn)錄酶來提高RNA修飾的檢測分辨率，這些修飾在逆轉(zhuǎn)錄過程中會誘導錯誤摻入，這些方法包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶TGIRT的m1A圖譜，用于m1A甲基化的高分辨率分析。此外，已經(jīng)開發(fā)出使用與不同樣本的RNA連接的條形碼適配器的m6A-seq2，用于同時檢測不同樣本的m6A動態(tài)，該方法可以擴展到使用其特異性抗體來檢測其他RNA修飾。
盡管基于抗體的方法具有多功能性，但其應用必須依賴于高質(zhì)量的抗體和大量的起始RNA�；诨瘜W誘導標記的亞硫酸鹽測序（BS-seq）以檢測m5C RNA修飾（圖1b）已被開發(fā)用于表觀轉(zhuǎn)錄組標記檢測。亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），從而產(chǎn)生一種可以以單核苷酸分辨率下繪制m5C的標記。在植物中，BS-seq已用于檢測tRNA、rRNA和mRNA中的m5C。
酶技術(shù)的最新發(fā)展為以抗體非依賴性方式定量繪制m6A的精確位點提供了另一種有用的替代方案。這些技術(shù)要么利用m6A敏感的RNA限制性內(nèi)切酶，如MAZTER-seq和m6A-REF-seq，要么利用m6A-erasers/readers，如m6A-SEAL和DART-seq，或利用二甲基轉(zhuǎn)移酶如MjDim1將m6A轉(zhuǎn)化為m62A的m6A選擇性烯丙基化學標記和測序（m6A-SAC-seq）。
（2）Nanopore直接RNA測序檢測表觀轉(zhuǎn)錄組標記位點
盡管上述基于下一代測序方法的表觀轉(zhuǎn)錄組分析方法為RNA修飾分布和調(diào)控提供了前所未有的見解，但在多個樣品中定量繪制RNA修飾圖譜仍然存在挑戰(zhàn)。此外這些方法在很大程度上依賴于基于短讀長cDNA的測序，其需要將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。相比之下，Nanopore（納米孔）長讀長直接RNA測序（DRS）平臺正在成為一種有前途的方法，用于定量繪制和比較不同條件下單核苷酸分辨率的RNA修飾（圖1b）。在植物中，通過nanopore DRS為兩個m6A-writers缺失的擬南芥突變體生成了高分辨率的差異和比較m6A甲基化組。此外，nanopore DRS和Tombo已被用于鑒定擬南芥中的m5C peaks，其總體模式與m5C-seq鑒定相似。
此外還開發(fā)了RAM-NPPS、BERMP和PEA等方法來檢測植物中的m6A水平。其中PEA檢測擬南芥中m6A的敏感性和特異性超過70%。所有檢測方法都有其優(yōu)點和缺點，如不同的m6A分析技術(shù)需要從100 ng到20μg的不同RNA起始量，具有不同的檢測分辨率和推斷化學計量信息的能力（圖1c）。在設(shè)計表觀轉(zhuǎn)錄組分析研究時，應將這些特征與要解決的生物學問題結(jié)合起來考慮。
表征植物表觀轉(zhuǎn)錄組參與者的研究進展
圖2：m6A和m5C的效應基因和分子功能概述。
- 擬南芥中m6A和m5C的效應基因和分子功能。m6A主要通過細胞核中的多組分m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合體沉積到其靶轉(zhuǎn)錄本上。該復合體可分為兩個子復合體，即m6A METTL復合體（MAC）和m6A METTL相關(guān)復合體（MACOM）。在藍光處理后，MTA、MTB和FIP37被招募到CRY2核體中，用于中心振蕩器轉(zhuǎn)錄本的m6A甲基化。另一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶FIO1單獨起作用，將m6A沉積在轉(zhuǎn)錄本的子集中。m6A被細胞核中的ALKBH10B或細胞質(zhì)中的應激顆粒（SG）中的ALkbH1B去除。m6A被細胞核中的CPSF30L或細胞質(zhì)中的ECT2/3識別。m5C由TRM4B催化。RNA修飾在許多方面影響RNA代謝，包括（1）選擇性多腺苷酸化，（2）翻譯，（3）RNA二級結(jié)構(gòu)，（4）RNA穩(wěn)定，（5）RNA定位，和（6）RNA轉(zhuǎn)運。
- 作物中m6A和m5C的一些已知效應基因。
表1：擬南芥中m6A和m5C效應基因的功能域，亞細胞定位和功能
植物m6A動態(tài)變化與調(diào)控研究進展
（1）不同植物的m6A特征
在包括梨、蘋果、草莓、大豆、甘藍型油菜、擬南芥、番茄、水稻、玉米等在內(nèi)多種植物中，已經(jīng)用m6A-seq或Nanopore DRS在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)對m6A靶標和分布進行廣泛的分析。m6A甲基化比率從普通小麥中的29%到13種植物中的51%不等。在從綠藻到高等陸生植物的大多數(shù)植物中，m6A在終止密碼子和3′UTR周圍中的分布偏好高度保守（圖3a），表明m6A是一種進化上保守的RNA修飾。盡管其豐度較低，但在梨、草莓、沙棘、甘藍型油菜和水稻等幾種植物中均檢測到CDS區(qū)域中的m6A標記。在極少數(shù)情況下，m6A在蘋果葉中的CDS區(qū)域富集最高。這些結(jié)果表明，CDS中的m6A可能是具有功能意義的重要特征。例如，在草莓果實成熟過程中，CDS中的m6A peaks值增加，意味著CDS中的m6A可能與不斷變化的發(fā)育環(huán)境有關(guān)。此外，在擬南芥、梨和沙棘的起始密碼子周圍，以及蘋果、甘藍型油菜和甜高粱的5’UTR內(nèi)也可以檢測到m6A富集。
圖3：植物中m6A RNA甲基化特征。
- 植物中m6A甲基化的關(guān)鍵特征概述。具有已知m6A譜的植物的系統(tǒng)發(fā)育樹中（左）。根據(jù)Pyrus bretschneideri（梨）、Malus hupehensis（蘋果）、Fragaria vesca（草莓）、Hippophae rhamnoides（沙棘）、Glycine max（大豆）、Populus trichocarpa（毛果楊）、Brassica rapa（甘藍型油菜）、Arabidopsis thaliana（擬南芥）、Gossypium hirsutum（棉花）、Solanum lycopersicum（番茄）、Triticum aestivum（普通小麥）、Aegilops tauschii（粗穗硬草）、Oryza sativa（水稻）、Sorghum bicolor（高粱）、Zea mays（玉米）、Physcomitrella patens（苔蘚）和Chlamydomonas reinhardtii（綠藻）的研究總結(jié)了關(guān)鍵的m6A特征（右）。在這些特征中，“與基因表達的相關(guān)性”在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)顯示。R=A/G；W=A/U；K=G/U；Y=C/U；D=A/G/U；H=A/C/U；V=A/G/C。
- m6A修飾受各種內(nèi)源性和環(huán)境信號的影響，如以下研究所示：發(fā)育階段（草莓、小麥）；不同植物器官（擬南芥）；生態(tài)型分化（擬南芥）；藍光效應（擬南芥）；高鹽脅迫（擬南芥、甜高粱、水稻、甜菜、棉花）；高溫/低溫脅迫（甘藍型油菜、擬南芥、番茄）；鎘脅迫（水稻、大麥）；干旱脅迫（沙棘、楊樹、蘋果）；病原體感染（蘋果、水稻、小麥、西瓜、梨）；線蟲感染（大豆）。
在不同植物中，m6A主要分為兩個序列motif，包括保守的RRACH motif和植物特異性的URUAY（Y=C/U）motif，獨特的AAACCV（V=A/G/C）motif僅在甘藍型油菜（pak choi）中有報道（圖3a）。另外，m6A可能出現(xiàn)在同一植物的不同發(fā)育階段的不同序列環(huán)境中。例如在普通小麥中，GAGGGAG和UGUAY motif分別出現(xiàn)在谷物和葉片的m6A peaks中。
（2）m6A分布的動態(tài)調(diào)節(jié)
m6A甲基化在不同的發(fā)育階段動態(tài)變化，并對不同植物的環(huán)境刺激做出響應（圖3b）。在包括根、蓮座葉和花在內(nèi)的不同擬南芥組織中，顯示差異m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本比例顯著大于顯示不同轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄本，表明m6A可能有助于器官分化。
m6A修飾也受到各種環(huán)境脅迫的動態(tài)影響。非生物脅迫（如鹽脅迫、干旱脅迫和高溫脅迫）或生物脅迫（如病毒和真菌疾�。�，不會顯著影響3'UTR和終止密碼子周圍的整體m6A分布模式，但會極大地誘導選定轉(zhuǎn)錄本上的動態(tài)m6A重新分布。鹽脅迫顯著增加擬南芥幼苗和水稻枝條中的m6A甲基化水平，但不增加水稻根中的m6A甲基化水平；鹽脅迫誘導m6A動態(tài)沉積到鹽脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中，以保護它們在擬南芥中不被降解，并且還增加一些耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的m6A甲基化，以增強它們在甜高粱中的RNA穩(wěn)定性。干旱脅迫會導致干旱響應基因的m6A水平發(fā)生變化，從而影響它們在蘋果中的表達水平。鎘（Cd）脅迫在大麥根中誘導轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A高甲基化并改變水稻中大量轉(zhuǎn)錄本的甲基化水平�？傊�，這些觀察結(jié)果表明應激誘導的m6A重新分布在應激響應中的重要作用。
盡管許多研究已經(jīng)揭示了植物m6A甲基化的動態(tài)變化在植物不同組織器官、不同年齡和不同應激依賴性方式中的重要作用，但迄今為止其潛在機制仍然難以捉摸。這種動態(tài)的m6A調(diào)節(jié)在各種情況下可以部分地通過滴定（titration）m6A writers和erasers水平來實現(xiàn)，從而導致整體的m6A水平重新分布。在擬南芥中，鹽脅迫可以通過上調(diào)m6A writer基因MTA、MTB、VIR和FIP37的表達而增加m6A甲基化（圖3c）。ALKBH10B表達也在鹽脅迫中上調(diào)，表明鹽脅迫誘導的m6A動態(tài)變化由m6A writers和erasers水平增加共同作用。干旱脅迫降低了沙棘中的m6A甲基化，這與m6A去甲基化酶基因HrALKBH10B/10C/10D的表達顯著增加有關(guān)。除轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，在各種條件下m6A效應基因的轉(zhuǎn)錄后修飾或m6A recruiters招募也可能促進m6A動態(tài)變化。例如在藍光處理后，MTA、MTB和FIP37被招募到CRY2核體中，用于中心振蕩器轉(zhuǎn)錄本上的選擇性m6A甲基化。進一步探索在各種條件下選擇性轉(zhuǎn)錄本上m6A動態(tài)變化的潛在機制將有助于對m6A依賴性動態(tài)調(diào)控的機制理解。
植物表觀轉(zhuǎn)錄組在基因調(diào)控中的研究進展
RNA修飾通過影響mRNA代謝的各個方面來決定植物mRNA命運，包括可變剪接（alternative splicing，AS）、可變聚腺苷酸化（alterative polyadenylation，APA）、折疊（folding）、翻譯、定位、轉(zhuǎn)運和衰變（圖2a和圖4）。這些對mRNA代謝的影響最終影響植物發(fā)育和應激響應中的一系列生理過程，正如對RNA修飾效應基因中缺陷的突變體集合所表征的。
圖4：表觀轉(zhuǎn)錄組介導的RNA代謝及其對植物發(fā)育、細胞過程和應激響應的影響。
a. OsEDM2L介導OsEAT1的m6A修飾，導致水稻花藥發(fā)育中OsEAT1的可變剪接。
b. m6A修飾影響擬南芥中的可變聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）。CPSF30L與m6A修飾的SOC1 mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)其APA并生成相對穩(wěn)定的SOC1轉(zhuǎn)錄本，從而導致較短的3'UTR以促進開花。CPSF30L還通過調(diào)節(jié)硝酸鹽信號通路中幾種m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本（包括NRT1.1和WRKY1）的APA來介導硝酸鹽信號。VIR介導鹽脅迫響應中幾種應激相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾和APA。
c. mRNA腺苷甲基化酶（MTA，METTL3的直系同源物）在鹽脅迫應答轉(zhuǎn)錄本上的m6A沉積與RNA二級結(jié)構(gòu)減少相關(guān)，導致RNA穩(wěn)定性增加。
d. m6A修飾影響幾種作物中的蛋白質(zhì)翻譯。在草莓果實成熟中，F(xiàn)veMTA和FveMTB介導的ABAR m6A修飾促進其翻譯。在蘋果中，MhYTP2與m6A修飾的MdGDH1L結(jié)合促進其翻譯以賦予白粉病抗性。在水稻中，OsNSUN2依賴性m5C修飾增加蛋白質(zhì)合成以增強水稻對熱應激的響應。
e. 在擬南芥中，m5C RNA修飾通過嫁接連接調(diào)控RNA轉(zhuǎn)運。
f. m6A修飾影響各種植物中的RNA穩(wěn)定性。在擬南芥中，F(xiàn)IP37和MTA介導的WUS和STM的m6A修飾降低了它們的mRNA穩(wěn)定性以維持正常的干細胞活性。m6A erasers ALKBH10B使FT、SPL3和SPL9去甲基化，從而增強其mRNA穩(wěn)定性以促進擬南芥開花。在水稻中，OsFIP37與OsFAP1相互作用以在OsYUCCA3轉(zhuǎn)錄本上沉積m6A修飾以促進雄性減數(shù)分裂所需的生長素生物合成。在番茄果實中，SlALKBH2去甲基化并增強SlDML2穩(wěn)定性以加速果實成熟。在草莓中，F(xiàn)veMTA和FveMTB在NCED5和AREB1轉(zhuǎn)錄本上沉積m6A修飾，從而增強其RNA穩(wěn)定性以促進果實成熟。在蘋果中，MhYTP2與MdMLO19和MdMLO19-X1的m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合，使其轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定以促進對白粉病的抗性。
g. TRM4B依賴性m5C修飾增強了其靶轉(zhuǎn)錄本在擬南芥根發(fā)育中的RNA穩(wěn)定性。
展望
在過去的十年中，植物表觀轉(zhuǎn)錄組在不同植物脅迫下的m6A動態(tài)以及對模式植物擬南芥和水稻中m6A和m5C修飾的機理理解方面取得了快速進展。目前的證據(jù)有力表明，表觀轉(zhuǎn)錄組學標記是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的重要層面，其決定mRNA命運并最終影響植物發(fā)育和對各種環(huán)境脅迫的響應。然而，我們對植物表觀轉(zhuǎn)錄組的理解仍處于起步階段。關(guān)于表觀轉(zhuǎn)錄組標記靶標選擇性和功能模式的許多未解決問題仍有待探索。例如，writers和erasers如何在不同的生理環(huán)境中選擇他們其標靶？mRNA修飾如何響應環(huán)境刺激而動態(tài)調(diào)節(jié)？reader蛋白如何識別其靶標并在隨后的RNA代謝過程中發(fā)揮作用？此外，由于RNA修飾高度依賴于細胞環(huán)境，在不同的組織和器官、不同的發(fā)育階段或不同的應激下，相關(guān)的調(diào)節(jié)通路可能不同。因此，有必要通過新開發(fā)的分析技術(shù)以單核苷酸分辨率分析從組織水平到細胞水平的RNA修飾動態(tài)變化，這將推進和擴展我們在植物表觀轉(zhuǎn)錄組知識的理解。
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