oxBS-seq測序揭示復(fù)發(fā)性膀胱癌甲基化和羥甲基化水平及相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化
近日，徐州市中心醫(yī)院（徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院）史振鐸等為第一作者、韓從輝教授為通訊作者在《Biomarker Research》雜志發(fā)表題為“Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression”的研究論文，該研究通過全外顯子組測序、簡化基因組甲基化測序（RRBS）+氧化簡化基因組甲基化測序（oxRRBS）及對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）等多組學(xué)方法揭示了復(fù)發(fā)性膀胱癌的甲基化和羥甲基化水平及相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化，并鑒定出用于預(yù)測PD-L1表達(dá)的生物標(biāo)志物。深圳市易基因科技為本研究提供oxRRBS+RRBS和RNA-seq測序服務(wù)。
標(biāo)題：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression
時(shí)間：2023-01-13
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 8.633
技術(shù)平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外顯子組測序等
研究摘要：
背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其高復(fù)發(fā)率和對免疫治療的響應(yīng)機(jī)制仍不清楚，導(dǎo)致臨床結(jié)果預(yù)測困難。表觀遺傳學(xué)變化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌進(jìn)展中起著重要作用，且越來越多地作為診斷或預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。然而，由于此前傳統(tǒng)的亞硫酸鹽測序方法（RRBS）不能區(qū)分5mC和5hmC信號，導(dǎo)致關(guān)于羥甲基化知之甚少。
方法：本研究使用多組學(xué)方法來繪制了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膀胱癌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜。
結(jié)果：本研究通過全外顯子組測序鑒定出參與UBC進(jìn)展的的基因突變（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而這些基因突變中與UBC復(fù)發(fā)或PD-L1下調(diào)幾乎不相關(guān)。整合RRBS和oxRRBS-seq數(shù)據(jù)，鑒定出在復(fù)發(fā)性膀胱癌中顯著富集5hmC相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化的脂肪酸氧化相關(guān)基因。在PD-L1高表達(dá)的膀胱癌樣本中發(fā)現(xiàn)NFATC1（一種高度參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答的基因）基因體中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因組中的5mC和5hmC變化呈負(fù)相關(guān)，因此僅基于RRBS數(shù)據(jù)結(jié)合了5mC和5hmC信號，減弱了癌癥相關(guān)信號標(biāo)記，不適合用作臨床生物標(biāo)志物。
結(jié)論：通過UBC樣本的多組學(xué)分析，結(jié)果表明表觀遺傳變化比基因突變更多參與UBC復(fù)發(fā)和PD-L1調(diào)節(jié)，證明了使用DNA甲基化標(biāo)記物預(yù)測膀胱癌患者免疫治療反應(yīng)的潛力。研究還表明僅僅采用RRBS方法聯(lián)合檢測5mC和5hmC水平會(huì)降低表觀遺傳生物標(biāo)志物的預(yù)測準(zhǔn)確性，揭示了使用oxRRBS-seq進(jìn)行甲基化標(biāo)記發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢。
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
（1）樣本選�。�
選取行腹腔鏡膀胱根治術(shù)（LRC）、膀胱部分切除術(shù)（PC）或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術(shù)后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲存在-80°C以進(jìn)行檢測。共采集45例患者膀胱組織標(biāo)本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。
（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：
結(jié)果圖形
圖1：單堿基分辨率對膀胱癌樣品進(jìn)行5mC和5hmC分析。
（A） 在膀胱癌樣品中鑒定出的顯著5mC和5hmC DMR數(shù)量。
（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。
膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。
膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。
（B） RNA-seq用5hmC DMR標(biāo)準(zhǔn)化脂肪酸代謝相關(guān)基因數(shù)量。
（C） 對TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗(yàn)證。
（D和E）復(fù)發(fā)性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發(fā)生復(fù)發(fā)性UBC的5名患者之間的相關(guān)性。
（B） PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標(biāo)記物的甲基化變化熱圖。
（C） PD-L1高表達(dá)膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖。
圖4：利用5mC生物標(biāo)志物預(yù)測免疫治療反應(yīng)。
（A） TET基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化水平變化。
（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預(yù)測PD-L1高表達(dá)的膀胱癌AUC評分。
（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預(yù)測PD-L1高表達(dá)膀胱癌的一種NFATC1-DMR預(yù)測AUC評分（右）。
總結(jié)：
本研究采用改進(jìn)的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統(tǒng)RRBS相結(jié)合。oxRRBS可以實(shí)現(xiàn)5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計(jì)算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細(xì)的表觀遺傳學(xué)信息，更適合用作膀胱癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。
關(guān)于精準(zhǔn)DNA甲基化/羥甲基化測序（oxBS-seq）
羥甲基化5hmC是哺乳動(dòng)物基因組上的第六堿基，在發(fā)育、衰老、神經(jīng)退行性疾病、復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為是檢測DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)的重亞硫酸鹽測序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。
易基因聯(lián)合劍橋大學(xué)建立了化學(xué)氧化法結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的測序技術(shù)（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術(shù)不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結(jié)合同時(shí)單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。
傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化無法區(qū)分5mC和5hmC
傳統(tǒng)的Bisulfite測序中，5hmC經(jīng)過Bisulfite處理后變?yōu)镃MS，CMS在測序中仍然被讀作C堿基，因此不能區(qū)分5mC和5hmC。
oxBS技術(shù)原理
技術(shù)優(yōu)勢：
技術(shù)指標(biāo)：
參考文獻(xiàn)：
Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.
標(biāo)題：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression
時(shí)間：2023-01-13
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 8.633
技術(shù)平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外顯子組測序等
背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其高復(fù)發(fā)率和對免疫治療的響應(yīng)機(jī)制仍不清楚，導(dǎo)致臨床結(jié)果預(yù)測困難。表觀遺傳學(xué)變化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌進(jìn)展中起著重要作用，且越來越多地作為診斷或預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。然而，由于此前傳統(tǒng)的亞硫酸鹽測序方法（RRBS）不能區(qū)分5mC和5hmC信號，導(dǎo)致關(guān)于羥甲基化知之甚少。
方法：本研究使用多組學(xué)方法來繪制了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膀胱癌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜。
結(jié)果：本研究通過全外顯子組測序鑒定出參與UBC進(jìn)展的的基因突變（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而這些基因突變中與UBC復(fù)發(fā)或PD-L1下調(diào)幾乎不相關(guān)。整合RRBS和oxRRBS-seq數(shù)據(jù)，鑒定出在復(fù)發(fā)性膀胱癌中顯著富集5hmC相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化的脂肪酸氧化相關(guān)基因。在PD-L1高表達(dá)的膀胱癌樣本中發(fā)現(xiàn)NFATC1（一種高度參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答的基因）基因體中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因組中的5mC和5hmC變化呈負(fù)相關(guān)，因此僅基于RRBS數(shù)據(jù)結(jié)合了5mC和5hmC信號，減弱了癌癥相關(guān)信號標(biāo)記，不適合用作臨床生物標(biāo)志物。
結(jié)論：通過UBC樣本的多組學(xué)分析，結(jié)果表明表觀遺傳變化比基因突變更多參與UBC復(fù)發(fā)和PD-L1調(diào)節(jié)，證明了使用DNA甲基化標(biāo)記物預(yù)測膀胱癌患者免疫治療反應(yīng)的潛力。研究還表明僅僅采用RRBS方法聯(lián)合檢測5mC和5hmC水平會(huì)降低表觀遺傳生物標(biāo)志物的預(yù)測準(zhǔn)確性，揭示了使用oxRRBS-seq進(jìn)行甲基化標(biāo)記發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢。
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
（1）樣本選�。�
選取行腹腔鏡膀胱根治術(shù)（LRC）、膀胱部分切除術(shù)（PC）或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術(shù)后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲存在-80°C以進(jìn)行檢測。共采集45例患者膀胱組織標(biāo)本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。
（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：
結(jié)果圖形
圖1：單堿基分辨率對膀胱癌樣品進(jìn)行5mC和5hmC分析。
（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。
膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。
膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。
圖2：復(fù)發(fā)性膀胱癌的5mC和5hmC分析。
（A） 在復(fù)發(fā)性膀胱癌樣品中鑒定出的5mC和5hmC DMR的數(shù)量（左），5mC和5hmC DMR的基因組注釋（右）。（B） RNA-seq用5hmC DMR標(biāo)準(zhǔn)化脂肪酸代謝相關(guān)基因數(shù)量。
（C） 對TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗(yàn)證。
（D和E）復(fù)發(fā)性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發(fā)生復(fù)發(fā)性UBC的5名患者之間的相關(guān)性。
圖3：PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥的甲基化變化。
（A） PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥樣本中鑒定的5mC和5hmC DMR數(shù)量（左），5mC和5hmC DMRs的基因組注釋（右）。（B） PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標(biāo)記物的甲基化變化熱圖。
（C） PD-L1高表達(dá)膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖。
圖4：利用5mC生物標(biāo)志物預(yù)測免疫治療反應(yīng)。
（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預(yù)測PD-L1高表達(dá)的膀胱癌AUC評分。
（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預(yù)測PD-L1高表達(dá)膀胱癌的一種NFATC1-DMR預(yù)測AUC評分（右）。
總結(jié)：
本研究采用改進(jìn)的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統(tǒng)RRBS相結(jié)合。oxRRBS可以實(shí)現(xiàn)5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計(jì)算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細(xì)的表觀遺傳學(xué)信息，更適合用作膀胱癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。
關(guān)于精準(zhǔn)DNA甲基化/羥甲基化測序（oxBS-seq）
羥甲基化5hmC是哺乳動(dòng)物基因組上的第六堿基，在發(fā)育、衰老、神經(jīng)退行性疾病、復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為是檢測DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)的重亞硫酸鹽測序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。
易基因聯(lián)合劍橋大學(xué)建立了化學(xué)氧化法結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的測序技術(shù)（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術(shù)不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結(jié)合同時(shí)單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。
傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化無法區(qū)分5mC和5hmC
傳統(tǒng)的Bisulfite測序中，5hmC經(jīng)過Bisulfite處理后變?yōu)镃MS，CMS在測序中仍然被讀作C堿基，因此不能區(qū)分5mC和5hmC。
oxBS技術(shù)原理
技術(shù)優(yōu)勢：
- DNA甲基化檢測全新的“標(biāo)準(zhǔn)”；
- 單堿基檢測DNA羥甲基化修飾；
- 多重質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)檢測氧化效率和Bisulfite轉(zhuǎn)換率；
- 實(shí)驗(yàn)偏好性低，重復(fù)性高（R2＞0.98）；
- 易基因自主研發(fā)的甲基化特異性多重PCR引物設(shè)計(jì)軟件；
- 可滿足多種測序應(yīng)用需求：
- 全基因組氧化甲基化測序（oxWGBS）
- 簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS）
- 目標(biāo)區(qū)域靶基因氧化甲基化測序（Target-oxBS）。
技術(shù)指標(biāo)：
參考文獻(xiàn)：
Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.
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