技術(shù)比拼之基于Flex技術(shù)的FFPE樣本單細(xì)胞RNA測(cè)序解決方案

福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE）樣本是臨床上長(zhǎng)期保存病理樣本的常用方法，其可以和有價(jià)值的臨床數(shù)據(jù)（如患者臨床資料，患者生存預(yù)后信息，用藥和治療療效等）相關(guān)聯(lián)，為確定疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究、生物標(biāo)記物和藥物靶標(biāo)提供了巨大的資源 ，是進(jìn)行回顧性研究的不二之選。但這種FFPE處理方式會(huì)使組織中的核酸發(fā)生不同程度的降解，在過(guò)去由于技術(shù)受限使FFPE樣本無(wú)法最大程度發(fā)揮自身的價(jià)值，

單細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值及火熱程度已無(wú)需贅述，然而目前市場(chǎng)上絕大部分高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)對(duì)待測(cè)樣本的細(xì)胞活性要求較高。以往的技術(shù)難以在RNA降解嚴(yán)重的FFPE樣本中獲得好的檢測(cè)結(jié)果。

值得歡慶的是，陸續(xù)有公司實(shí)現(xiàn)了技術(shù)突破，并提供了對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的全新解決方案，其中10x Genomics推出的Flex技術(shù)和躍真生物（M20 Genomics）推出的M20技術(shù)非常具有代表性。
 

伯豪生物始終緊跟技術(shù)前沿，目前已針對(duì)這兩個(gè)新技術(shù)進(jìn)行了全面調(diào)研，并通過(guò)對(duì)FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)行多次測(cè)試與評(píng)估。接下來(lái)我們會(huì)根據(jù)調(diào)研及測(cè)評(píng)結(jié)果分別從技術(shù)原理，技術(shù)特點(diǎn)，尤其是測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量等方面對(duì)這兩個(gè)技術(shù)進(jìn)行全面介紹。

Flex技術(shù)原理及工作流程
單細(xì)胞基因表達(dá)Flex技術(shù)通過(guò)探針雜交的方式捕獲靶基因，可捕獲到降解的RNA，再進(jìn)行細(xì)胞捕獲建庫(kù)測(cè)序。針對(duì) FFPE切片，首先將樣本制備成單細(xì)胞懸浮液，進(jìn)而抽核得到細(xì)胞核樣本；然后采用靶向基因的探針對(duì)雜交目標(biāo)RNA分子后連接的原理，進(jìn)而完成文庫(kù)構(gòu)建。該方法能夠?qū)θ嘶蛐∈蟮腇FPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，可以用來(lái)分析數(shù)千個(gè)至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核的基因表達(dá)。
 

圖 單細(xì)胞基因表達(dá)Flex技術(shù)原理

Flex技術(shù)優(yōu)勢(shì)

▪ 擴(kuò)大了樣本范圍：能對(duì)FFPE細(xì)胞和組織，以及PFA固定樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析，而不再受限于是否有新鮮組織可用，可以解鎖大量?jī)?chǔ)存在醫(yī)院以及生物樣本庫(kù)中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

▪ 簡(jiǎn)化了工作流程：FFPE樣本比較容易獲取，易運(yùn)輸，并且樣本收集相對(duì)經(jīng)濟(jì)成本低。使樣本采集更加靈活，實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排更加方便。

▪ 提升了低表達(dá)基因檢測(cè)靈敏度：根據(jù)Flex和3’轉(zhuǎn)錄組的實(shí)測(cè)對(duì)比數(shù)據(jù)結(jié)果，在多種樣本類型中，相同的測(cè)序數(shù)據(jù)量下，F(xiàn)lex所得的測(cè)序數(shù)據(jù)飽和度更高，探針靈敏度更強(qiáng)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到的基因數(shù)更多。

▪ 與10x Visium CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組更配：Flex技術(shù)與10x同期推出的Visium CytAssist技術(shù)完美結(jié)合，能夠通過(guò)同一套探針對(duì)同一FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組研究，基因表達(dá)一致性更高，數(shù)據(jù)聯(lián)合分析匹配性更好。
 

FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序?qū)崪y(cè)數(shù)據(jù)展示

下面來(lái)到大家最關(guān)心的環(huán)節(jié)：FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量表現(xiàn)如何？10x官方測(cè)試了多種人的FFPE組織樣本（如乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌等等），測(cè)試結(jié)果顯示不同組織類型的FFPE樣本，其檢測(cè)到的基因中位數(shù)在400-1500之間。嚴(yán)謹(jǐn)如我，伯豪當(dāng)然要對(duì)這一官方數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)試評(píng)估的。

目前伯豪已基于Flex技術(shù)對(duì)FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)行多次測(cè)試。下面我們就用真實(shí)的數(shù)據(jù)說(shuō)可靠的結(jié)論！以下為大家展示用Flex技術(shù)對(duì)兩個(gè)前列腺癌FFPE樣本檢測(cè)的結(jié)果。

（1）FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序基本信息統(tǒng)計(jì)

單細(xì)胞測(cè)序基本信息統(tǒng)計(jì)中我們比較關(guān)注的兩個(gè)指標(biāo)是細(xì)胞數(shù)和中位基因數(shù)。從測(cè)序結(jié)果來(lái)看，兩個(gè)前列腺癌FFPE樣本測(cè)到的細(xì)胞數(shù)分別為9865，25231（上機(jī)細(xì)胞數(shù)分別為2萬(wàn)和5萬(wàn)個(gè)，即達(dá)到了50%的捕獲效率）；每個(gè)細(xì)胞測(cè)到的中位基因值為1243，1414（均>1000）。測(cè)試結(jié)果表明不管是檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)還是基因數(shù)都是很可觀的呢。

細(xì)胞群鑒定結(jié)果是單細(xì)胞測(cè)序重重要的一個(gè)結(jié)果了，沒(méi)有之一。為評(píng)價(jià)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序得到的細(xì)胞鑒定結(jié)果的優(yōu)劣，小編找了一篇Nat Cell Biol（IF：28.213）發(fā)表的用前列腺癌新鮮組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞研究的文章進(jìn)行比較。結(jié)果可看出FFPE樣本（右圖）測(cè)序得到的主要細(xì)胞類型與新鮮組織樣本（左圖）測(cè)序得到的細(xì)胞類型基本一致。測(cè)試結(jié)果表明基于Flex技術(shù)的FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序能夠鑒定出到豐富的細(xì)胞類群。

篇幅有限，這里就不再展示更多結(jié)果。測(cè)試結(jié)論就是，基于單細(xì)胞基因表達(dá)Flex技術(shù)可解鎖FFPE樣本研究的新世界！另：伯豪重磅推出FFPE石蠟樣本多組學(xué)一站式解決方案，直接將FFPE樣本的研究?jī)r(jià)值buff加滿！
 

FFPE樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用

FFPE樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域與已往以新鮮樣本做的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性、器官圖譜構(gòu)建、神經(jīng)科學(xué)、免疫研究以及疾病分子機(jī)制/生物標(biāo)志物等研究領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。值得注意的是，以FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同樣可以應(yīng)用于這些領(lǐng)域。此外，基于FFPE樣本的特點(diǎn)（如有大量樣本庫(kù)，可關(guān)聯(lián)患者臨床信息等），F(xiàn)FPE樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在臨床回顧性研究，多組學(xué)聯(lián)合分析（尤其是與空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析）等方面更具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在此獻(xiàn)上全球首篇FFPE空間轉(zhuǎn)錄組分析高分文獻(xiàn)詳解。
 

FFPE樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文章案例

基于Flex技術(shù)進(jìn)行FFPE樣本單細(xì)胞RNA測(cè)序研究，因?yàn)榧夹g(shù)較新，目前還沒(méi)有正式發(fā)表的文章，下面給大家展示兩篇預(yù)印版的案例文章。

案例1：FFPE組織的單細(xì)胞+空轉(zhuǎn)+原位分析聯(lián)合繪制高分辨率乳腺癌微環(huán)境圖譜

文章標(biāo)題：High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue
發(fā)表平臺(tái)：bioRxiv
發(fā)表時(shí)間：2022年10月
文章摘要：該研究對(duì)一個(gè)乳腺癌FFPE 樣本進(jìn)行連續(xù)切片，然后用單細(xì)胞基因表達(dá)（Chromium Flex，scFFPE-seq)），空間轉(zhuǎn)錄組(Visium CytAssist))，和原位技術(shù)(Xenium In Situ)這三種與FFPE樣本兼容的技術(shù)對(duì)乳腺癌FFPE 樣本進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)這三種數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，實(shí)現(xiàn)了FFPE樣本單細(xì)胞水平下基因表達(dá)，空間信息及原位蛋白表達(dá)信息的整合。其中scFFPE-seq和Viium數(shù)據(jù)聯(lián)合分析鑒定出17種不同的細(xì)胞類型，再通過(guò)將轉(zhuǎn)錄本映射到 Xenium 數(shù)據(jù)中，以單細(xì)胞分辨率在空間層面上解析這些細(xì)胞類型及其基因表達(dá)特征，從而展示了樣本高空間分辨的全轉(zhuǎn)錄組信息。
 

圖 用三種互補(bǔ)技術(shù)（scFFPE-seq，Visium，Xenium）對(duì)單個(gè)FFPE樣本進(jìn)行了聯(lián)合分析

案例2：肺癌患者匹配的新鮮和FFPE癌組織的單細(xì)胞RNA譜與臨床特征研究

文章標(biāo)題：Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffinembedded (FFPE) lung cancer tissue
發(fā)表平臺(tái)：bioRxiv
發(fā)表時(shí)間：2023年4月
文章摘要：該研究對(duì)肺癌患者匹配的新鮮、冷凍和FFPE癌組織的單細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試。研究發(fā)現(xiàn)，新鮮組織和FFPE樣本可以用于在單細(xì)胞水平上穩(wěn)健地檢測(cè)臨床相關(guān)特征，即可以通過(guò)單細(xì)胞RNA表達(dá)譜探究細(xì)胞亞型簇顯示出的信號(hào)通路、Hallmark等臨床相關(guān)信號(hào)。此外，與新鮮組織相比，F(xiàn)FPE組織顯示了更高的細(xì)胞多樣性，能夠很好地保存細(xì)胞類型和患者特征的臨床相關(guān)信息。在臨床中，新鮮組織單細(xì)胞分析僅允許前瞻性采集樣本，而FFPE組織的單核轉(zhuǎn)錄組學(xué)允許用長(zhǎng)期臨床隨訪數(shù)據(jù)(如治療反應(yīng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和患者存活)的隊(duì)列進(jìn)行回顧性研究�？傊�，來(lái)自FFPE組織的單細(xì)胞RNA測(cè)序與來(lái)自新鮮組織的分析相當(dāng)，可以取代來(lái)自新鮮組織的分析。
 

圖 新鮮組織及FFPE樣本snRNA-seq細(xì)胞群及細(xì)胞亞群鑒定結(jié)果

小編劃重點(diǎn)
不管是我們的測(cè)試數(shù)據(jù)，還是實(shí)例文章的分析結(jié)果均證明了Flex技術(shù)對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序的穩(wěn)健性及可行性。那M20 Genomics公司的M20技術(shù)表現(xiàn)如何呢？?jī)杉夹g(shù)相比又各自有什么優(yōu)劣呢？我們下篇揭曉答案。點(diǎn)擊閱讀《技術(shù)比拼之M20技術(shù)下的FFPE樣本單細(xì)胞RNA測(cè)序原理及技術(shù)特點(diǎn)》

無(wú)論如何，FFPE樣本高通量單細(xì)胞測(cè)序的新世界大門已經(jīng)打開(kāi)，想要搶占這第一波紅利的，抓緊上車！