組學(xué)研究揭示不同牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)和基因表達互作機制
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
在全球范圍內(nèi)，牛為60多億人提供了重要的營養(yǎng)來源。傳染病是養(yǎng)牛生產(chǎn)的主要限制因素，且許多疾病人畜共患，因此與人類健康直接相關(guān)。近年來牛的許多復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)得到了廣泛研究，但不同動物的大量重要表型變化仍無法解釋，人們越來越關(guān)注非遺傳變異（包括基因表達、DNA甲基化和染色質(zhì)）與重要牛表型的潛在相關(guān)性。為充分了解牛性狀的非遺傳成分、基因與環(huán)境互作的重要性以及遺傳變異如何通過甲基化影響表型，有必要分析整個基因組中的染色質(zhì)和甲基化狀態(tài)，并了解其在動物和品種中的變化方式和位置。
2023年05月22日，愛丁堡大學(xué)皇家 (迪克) 獸醫(yī)學(xué)院Liam J. Morrison和 James G. D. Prendergast團隊在《Genome Biology》雜志發(fā)表了題為“Profiling the immune epigenome across global cattle breeds”的研究論文，該研究通過使用簡化甲基化測序（RRBS）、ATAC-seq、RNA-seq繪制了Holstein Friesian（歐洲taurine）、 N’Dama（非洲taurine）和 Nelore（印度indicine）三個不同牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和RNA表達譜。
標(biāo)題：Profiling the immune epigenome across global cattle breeds（分析不同牛品種的免疫表觀基因組）
時間：2023.05.22
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 17.906
技術(shù)平臺：RRBS、ATAC-seq、RNA-seq
樣本實驗：
Holstein Friesian牛（歐洲taurine）、 N’Dama牛（非洲taurine）、Nelore牛（印度indicine）三種不同雌性牛品種（每個品種三頭）的七個主要血液免疫細胞類型（B細胞、CD4 αβ T細胞、CD8 αβ T細胞、γδ T細胞、NK細胞，單核細胞和粒細胞）
研究摘要：
了解對當(dāng)?shù)丨h(huán)境和病原體適應(yīng)良好和適應(yīng)性差的牛品種間差異對于培育具有改良氣候和抗病表型的牛至關(guān)重要。盡管在鑒定品種間的遺傳差異方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進展，但表觀遺傳和染色質(zhì)水平變化仍未表征。本研究以單堿基分辨率生成、測序和分析了150多個文庫，以研究三個不同牛譜系中牛免疫系統(tǒng)的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性變化。研究結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)taurine牛和indicine牛在免疫細胞類型上存在廣泛的表觀遺傳差異，這與兩個牛譜系之間的局部DNA序列差異水平有關(guān)。特異性細胞類型譜能夠使用數(shù)字細胞術(shù)對復(fù)雜的細胞混合物進行反卷積。最后，根據(jù)CpG島的染色質(zhì)和甲基化譜分析了CpG島的不同亞群類別，這些亞群區(qū)分了與離散轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)的遠端島和基因近端島。
本研究提供了三個不同牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和RNA表達譜的綜合資源�？赡軐υO(shè)計有效的非歐洲品種牛表觀基因組廣泛關(guān)聯(lián)研究產(chǎn)生不同的影響。
研究結(jié)果
（1）染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組免疫圖譜的生成和驗證
分別以Holstein Friesian牛、N'Dama牛和Nelore牛的7種主要血液免疫細胞類型（B細胞、CD4αβT細胞、CD8αβT細胞、γδT細胞、NK細胞、單核細胞和粒細胞）為靶點，使用RRBS和ATAC-seq分析全基因組DNA甲基化和染色質(zhì)可及性（圖1A）。由于N’Dama牛品種在樣本采集和細胞分離中的挑戰(zhàn)，該品種的4個ATAC-seq和3個RRBS樣本被排除在研究之外。因此，三個品種九頭牛的B細胞、CD4αβT細胞、γδT細胞和單核細胞數(shù)據(jù)總共產(chǎn)生了119個文庫。為了在下游分析中進行比較，還為來自Holstein Friesian牛和Nelore牛的細胞類型子集生成了26個RNA-seq文庫。
與預(yù)期一致，ATAC-seq數(shù)據(jù)顯示片段長度具有明顯的周期性，與跨越不同核小體數(shù)量的片段一致。RRBS數(shù)據(jù)在CpG島（CgIsland，CGI）顯著富集，所有樣本中CpG島約56%的CpG位點至少有10reads覆蓋，另25%位于CGI附近2 kb區(qū)域的CGI海岸（圖2A）。相比之下，只有約1%的參考基因組含有CGI。與許多含有CGI的基因啟動子一致，48%的CpG位點位于啟動子區(qū)域（圖2B）。
圖2：細胞類型和牛譜系之間的DNA甲基化差異。所有樣本的CpG位點（9084個位點）中至少有10reads覆蓋位點。
A~B. CpG位點注釋與定義的基因組特征重疊。當(dāng)CpG位點與多個基因組特征重疊時，優(yōu)先順序：啟動子>外顯子>內(nèi)含子。
C. CpG位點甲基化水平的PCA分析。
D. 基于CpG位點甲基化水平的樣品無監(jiān)督分層聚類。根據(jù)Spearman相關(guān)系數(shù)對樣本進行聚類，其中前50% CpG位點在所有樣本（4542個位點）中表現(xiàn)出最高標(biāo)準(zhǔn)偏差。gdT細胞表示γδT細胞
（2）細胞類型和牛譜系之間的差異甲基化
通過對細胞類型、牛品種和牛譜系的成對比較來分析樣本的CGI甲基化水平。對24598個CGI進行分析，其中3036個CGI在至少一個比較中存在顯著差異（q值≤0.01，甲基化水平差異≥25%）。成對比較中差異甲基化CpG島（DMI）的共存如圖3A。這些DMI中的大多數(shù)（2675）是在B細胞與另一種細胞類型的比較中鑒定出來的�？偟膩碚f，在至少一個品種或譜系的比較中鑒定出348個DMI，與歐洲和非洲兩個taurine品種相比，200個DMI在indicine中具有特異性甲基化譜。
（3）牛譜系之間遺傳和表觀遺傳差異之間的相關(guān)性
B。IBS（左）或FST評分（右）與細胞類型和群體比較甲基化差異之間的關(guān)聯(lián)。每個細胞表示特定細胞類型中的甲基化差異與群體比較（行）以及成對群體（列）之間的遺傳差異之間的關(guān)聯(lián)強度。黃色/紅色顯示顯著關(guān)聯(lián)（校正FDR P<0.05），白色/藍色顯示不顯著結(jié)果。HF=Holstein Friesian，ND=N'Dama，NL=Nelore，Ind=Bos indicus
(4) 將CpG島分為六個簇，每個品種具有不同的表觀遺傳譜
B、 Circos圖顯示品種對之間不同聚類的CGI重疊程度。優(yōu)先順序如下：Holstein Friesian>N'Dama>Nelore。最外層標(biāo)簽表示聚類分析中使用的品種數(shù)據(jù)，后跟聚類編號。最外面條形圖顯示屬于其他兩個品種聚類的每個品種中CGI的相對重疊。
（5）基于DNA甲基化譜的復(fù)雜細胞混合物反卷積
易基因小結(jié)：
本研究生成了全面的數(shù)據(jù)集，為七種免疫細胞類型和三個牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和基因表達互作提供了見解。本研究數(shù)據(jù)將有助于鑒定不同細胞類型、不同牛品種和物種的保守或不同的表觀遺傳模式和調(diào)控機制。這將有助于理解進化譜系表型變異的過程，在功能上驗證與性狀相關(guān)的遺傳變異，并有助于牛的遺傳改良計劃，以培育具有更強大免疫系統(tǒng)的動物。
參考文獻：
Powell J, Talenti A, Fisch A, Hemmink JD, Paxton E, Toye P, Santos I, Ferreira BR, Connelley TK, Morrison LJ, Prendergast JGD. Profiling the immune epigenome across global cattle breeds. Genome Biol. 2023 May 22;24(1):127.
在全球范圍內(nèi)，牛為60多億人提供了重要的營養(yǎng)來源。傳染病是養(yǎng)牛生產(chǎn)的主要限制因素，且許多疾病人畜共患，因此與人類健康直接相關(guān)。近年來牛的許多復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)得到了廣泛研究，但不同動物的大量重要表型變化仍無法解釋，人們越來越關(guān)注非遺傳變異（包括基因表達、DNA甲基化和染色質(zhì)）與重要牛表型的潛在相關(guān)性。為充分了解牛性狀的非遺傳成分、基因與環(huán)境互作的重要性以及遺傳變異如何通過甲基化影響表型，有必要分析整個基因組中的染色質(zhì)和甲基化狀態(tài)，并了解其在動物和品種中的變化方式和位置。
2023年05月22日，愛丁堡大學(xué)皇家 (迪克) 獸醫(yī)學(xué)院Liam J. Morrison和 James G. D. Prendergast團隊在《Genome Biology》雜志發(fā)表了題為“Profiling the immune epigenome across global cattle breeds”的研究論文，該研究通過使用簡化甲基化測序（RRBS）、ATAC-seq、RNA-seq繪制了Holstein Friesian（歐洲taurine）、 N’Dama（非洲taurine）和 Nelore（印度indicine）三個不同牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和RNA表達譜。
標(biāo)題：Profiling the immune epigenome across global cattle breeds（分析不同牛品種的免疫表觀基因組）
時間：2023.05.22
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 17.906
技術(shù)平臺：RRBS、ATAC-seq、RNA-seq
樣本實驗：
Holstein Friesian牛（歐洲taurine）、 N’Dama牛（非洲taurine）、Nelore牛（印度indicine）三種不同雌性牛品種（每個品種三頭）的七個主要血液免疫細胞類型（B細胞、CD4 αβ T細胞、CD8 αβ T細胞、γδ T細胞、NK細胞，單核細胞和粒細胞）
研究摘要：
了解對當(dāng)?shù)丨h(huán)境和病原體適應(yīng)良好和適應(yīng)性差的牛品種間差異對于培育具有改良氣候和抗病表型的牛至關(guān)重要。盡管在鑒定品種間的遺傳差異方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進展，但表觀遺傳和染色質(zhì)水平變化仍未表征。本研究以單堿基分辨率生成、測序和分析了150多個文庫，以研究三個不同牛譜系中牛免疫系統(tǒng)的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性變化。研究結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)taurine牛和indicine牛在免疫細胞類型上存在廣泛的表觀遺傳差異，這與兩個牛譜系之間的局部DNA序列差異水平有關(guān)。特異性細胞類型譜能夠使用數(shù)字細胞術(shù)對復(fù)雜的細胞混合物進行反卷積。最后，根據(jù)CpG島的染色質(zhì)和甲基化譜分析了CpG島的不同亞群類別，這些亞群區(qū)分了與離散轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)的遠端島和基因近端島。
本研究提供了三個不同牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和RNA表達譜的綜合資源�？赡軐υO(shè)計有效的非歐洲品種牛表觀基因組廣泛關(guān)聯(lián)研究產(chǎn)生不同的影響。
研究結(jié)果
（1）染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組免疫圖譜的生成和驗證
分別以Holstein Friesian牛、N'Dama牛和Nelore牛的7種主要血液免疫細胞類型（B細胞、CD4αβT細胞、CD8αβT細胞、γδT細胞、NK細胞、單核細胞和粒細胞）為靶點，使用RRBS和ATAC-seq分析全基因組DNA甲基化和染色質(zhì)可及性（圖1A）。由于N’Dama牛品種在樣本采集和細胞分離中的挑戰(zhàn)，該品種的4個ATAC-seq和3個RRBS樣本被排除在研究之外。因此，三個品種九頭牛的B細胞、CD4αβT細胞、γδT細胞和單核細胞數(shù)據(jù)總共產(chǎn)生了119個文庫。為了在下游分析中進行比較，還為來自Holstein Friesian牛和Nelore牛的細胞類型子集生成了26個RNA-seq文庫。
圖1：三個遺傳多樣性牛品種原代血細胞中染色質(zhì)景觀研究
- 從Holstein Friesian牛、N'Dama牛和Nelore牛（每個品種三頭）共九頭牛中收集的RRBS，ATAC-seq和RNA-seq細胞類型概述示意圖。底部顯示了每個品種收集的RRBS、ATAC-seq和RNA-seq樣品總數(shù)。
- �；蛐蛿�(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）。使用298頭牛的27379808個變體進行分析。
- 免疫相關(guān)基因的甲基化水平、染色質(zhì)可及性和基因表達。熱圖顯示免疫相關(guān)基因啟動子的甲基化（左）和染色質(zhì)可及性（中）及其相應(yīng)表達（右）（TSS上游1000 bp和下游500 bp）。右側(cè)條形圖顯示了每個轉(zhuǎn)錄本的TSS與最近CGI的距離。甲基化熱圖中的黑條表示在給定啟動子中發(fā)現(xiàn)少于5個CpG位點被至少5個reads覆蓋的樣品。SIRPA表示SIRPα，gdT細胞表示γδT細胞。該圖表明與以前的報道一致，CD4+CD8+雙陽性T細胞的數(shù)量可能很少，因為CD4和CD8表達在很大程度上靶向各自細胞類型。
與預(yù)期一致，ATAC-seq數(shù)據(jù)顯示片段長度具有明顯的周期性，與跨越不同核小體數(shù)量的片段一致。RRBS數(shù)據(jù)在CpG島（CgIsland，CGI）顯著富集，所有樣本中CpG島約56%的CpG位點至少有10reads覆蓋，另25%位于CGI附近2 kb區(qū)域的CGI海岸（圖2A）。相比之下，只有約1%的參考基因組含有CGI。與許多含有CGI的基因啟動子一致，48%的CpG位點位于啟動子區(qū)域（圖2B）。
A~B. CpG位點注釋與定義的基因組特征重疊。當(dāng)CpG位點與多個基因組特征重疊時，優(yōu)先順序：啟動子>外顯子>內(nèi)含子。
C. CpG位點甲基化水平的PCA分析。
D. 基于CpG位點甲基化水平的樣品無監(jiān)督分層聚類。根據(jù)Spearman相關(guān)系數(shù)對樣本進行聚類，其中前50% CpG位點在所有樣本（4542個位點）中表現(xiàn)出最高標(biāo)準(zhǔn)偏差。gdT細胞表示γδT細胞
（2）細胞類型和牛譜系之間的差異甲基化
通過對細胞類型、牛品種和牛譜系的成對比較來分析樣本的CGI甲基化水平。對24598個CGI進行分析，其中3036個CGI在至少一個比較中存在顯著差異（q值≤0.01，甲基化水平差異≥25%）。成對比較中差異甲基化CpG島（DMI）的共存如圖3A。這些DMI中的大多數(shù)（2675）是在B細胞與另一種細胞類型的比較中鑒定出來的�？偟膩碚f，在至少一個品種或譜系的比較中鑒定出348個DMI，與歐洲和非洲兩個taurine品種相比，200個DMI在indicine中具有特異性甲基化譜。
圖3：細胞類型、牛品種和牛譜系之間差異甲基化CGI的比較。
- 在標(biāo)記的成對比較中鑒定出差異甲基化CGI（甲基化差異≥25%，q值≥0.01）的Upset plot圖。右側(cè)條形圖顯示了每次比較中顯著差異甲基化CGI數(shù)量。頂部注釋條顯示了在黑點指示比較中顯著差異甲基化的CGI數(shù)量。僅顯示至少6個顯著差異甲基化CGI的比較集。底部箱形圖顯示了CGI在每個組合集中到蛋白質(zhì)編碼基因的最近TSS距離分布。左側(cè)文本表示在每個成對比較中比較的組，其中“.”將組1和組2分開。
- Holstein Friesian牛（歐洲taurine）、 N'Dama牛（非洲taurine）、Nelore牛（印度indicine）之間差異甲基化的CGI熱圖。CGI僅限TSS 2000 bp內(nèi)，且在所有樣品中最近基因的平均表達均>10 TPM。RNA-seq log2FC是平均Holstein Friesian RNA-seq信號和平均Nelore RNA-seq信號之間的log2倍變化，其中正log2FC（紅點）表示Holstein Friesian牛中高表達，負log2FC（藍點）表示Nelore牛中較表達。Bcell =B細胞，CD4=CD4 T細胞，CD8=CD8 T細胞，gdT=γδT細胞，NK=NK細胞，mono =單核細胞，gran =粒細胞
（3）牛譜系之間遺傳和表觀遺傳差異之間的相關(guān)性
圖4：種群間甲基化差異升高的CpG島平均顯示遺傳差異升高。
A、CGI狀態(tài)的平均同一性表明，將所有細胞類型放在一起比較，Holstein Friesian和Nelore品種之間的甲基化差異水平不同。顯示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。與這對種群之間的其他CGI（綠色）相比，甲基化差異相對較高的CGI通常也顯示出較高的遺傳差異（IBS較低）。相反，種群間的甲基化差異在很大程度上與個體群體內(nèi)計算的IBS評分無關(guān)（灰色）。B。IBS（左）或FST評分（右）與細胞類型和群體比較甲基化差異之間的關(guān)聯(lián)。每個細胞表示特定細胞類型中的甲基化差異與群體比較（行）以及成對群體（列）之間的遺傳差異之間的關(guān)聯(lián)強度。黃色/紅色顯示顯著關(guān)聯(lián)（校正FDR P<0.05），白色/藍色顯示不顯著結(jié)果。HF=Holstein Friesian，ND=N'Dama，NL=Nelore，Ind=Bos indicus
(4) 將CpG島分為六個簇，每個品種具有不同的表觀遺傳譜
圖5：CGI的無監(jiān)督聚類分析鑒定出不同的染色質(zhì)景觀。
A、Holstein Friesian牛數(shù)據(jù)中 CGI甲基化水平和ATAC-seq信號聚類分析（RPKM）。聚類采用期望最大化（EM）算法擬合的有限高斯混合模型（GMM）進行。每個CGI僅配對一個TSS附近基因。顯示每個CGI附近基因的RNA-seq表達以及每個CGI與TSS附近距離。簇通過增加中位甲基化水平進行排序，并根據(jù)此順序編號。B、 Circos圖顯示品種對之間不同聚類的CGI重疊程度。優(yōu)先順序如下：Holstein Friesian>N'Dama>Nelore。最外層標(biāo)簽表示聚類分析中使用的品種數(shù)據(jù)，后跟聚類編號。最外面條形圖顯示屬于其他兩個品種聚類的每個品種中CGI的相對重疊。
（5）基于DNA甲基化譜的復(fù)雜細胞混合物反卷積
圖6：基于DNA甲基化譜的細胞混合物反卷積
- 每個體外混合物和裂解血液樣本中細胞亞群相對比例條形圖。體外細胞混合物，“expected”是指用于生成混合物的FACS純化細胞類型的已知比例。對于裂解的血液樣本，“expected”是指通過流式細胞術(shù)分析的每個細胞亞群的比例。每個混合物的后續(xù)四條顯示CIBERSORTx使用指定品種的參考樣本分析的每種細胞類型比例。
易基因小結(jié)：
本研究生成了全面的數(shù)據(jù)集，為七種免疫細胞類型和三個牛品種的DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和基因表達互作提供了見解。本研究數(shù)據(jù)將有助于鑒定不同細胞類型、不同牛品種和物種的保守或不同的表觀遺傳模式和調(diào)控機制。這將有助于理解進化譜系表型變異的過程，在功能上驗證與性狀相關(guān)的遺傳變異，并有助于牛的遺傳改良計劃，以培育具有更強大免疫系統(tǒng)的動物。
參考文獻：
Powell J, Talenti A, Fisch A, Hemmink JD, Paxton E, Toye P, Santos I, Ferreira BR, Connelley TK, Morrison LJ, Prendergast JGD. Profiling the immune epigenome across global cattle breeds. Genome Biol. 2023 May 22;24(1):127.
標(biāo)簽：
RRBS
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